Western-Blot蛋白免疫印迹法.doc

《Western-Blot蛋白免疫印迹法.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、3Westernblot3.1试剂配制1）30%聚丙烯酰胺储备液（Acr/Bis）：丙烯酰胺（Acr），29g；N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis），1g，去离子水溶解，37℃水浴助溶，定容至100mL。0.45μm滤器过滤，棕色瓶4℃避光保存。2）10%十二烷基硫酸钠（SDS）：SDS，10g；H2O，80mL。68℃加热溶解，浓HCl调pH至7.2，定容至100mL，室温保存。3）10%过硫酸铵（AP）：AP，1g；H2O，10mL。避光，4℃保存。（4℃2周）4）分离胶缓冲液（1.5MTris-HClpH8

2、.8）：Tris，18.17g；H2O80mL。用浓HCl调pH至8.8，定容至100mL，4℃保存。5）浓缩胶缓冲液（1.0MTris-HClpH6.8）：Tris，12.11g；H2O80mL。用浓HCl调pH至6.8，定容至100mL，4℃保存。6）电泳缓冲液（10×）：甘氨酸（Glycine），188g；Tris30.2g；SDS，10g；H2O，800mL。调节pH至8.3，定容至1L，4℃保存（用时稀释为1×）。7）5×SDS-PAGEloadingBuffer（5mL）：1MTris-HCl（pH

3、6.8），1.25mL；SDS，0.5g；溴酚蓝（BPB），25mg；甘油，2.5mL；加去离子水定容至5mL。充分混匀，分装成500μL/份，室温保存。使用前每份加入25μLβ-巯基乙醇（2-ME），加入2-ME的loadingbuffer可在室温下保存一个月左右。8）考马斯亮蓝染色固定液：40%双蒸水,10%醋酸,50%甲醇，室温保存9）考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-250，250mg；甲醇，45ml；冰醋酸，10ml；H2O，定容至100ml。室温保存。10）考马斯亮蓝染色脱色液：醋酸，100ml；乙醇

4、，50ml；dH2O850ml，充分混合，室温保存11）膜转移缓冲液：甘氨酸，2.9g；Tris，5.8g；SDS，0.37g；加H2O600mL充分溶解，加200mL甲醇，混匀，定容至1L，室温保存。12）TBS缓冲液：NaCl，8.8g；1MTis-HCL(pH8.0)，20ml，加入约800H2O搅拌溶解，定容至1L，4℃保存。13）TBST缓冲液：NaCl，8.8g；1MTis-HCL(pH8.0)，20ml，加入约800H2O搅拌溶解，加入0.5mlTween20后充分混匀，去离子水定容至1L，4℃保

5、存。14）1MTis-HCL(pH8.0)：Tris121.1g置于1L烧杯，加入约800ml去离子水，充分搅拌，加入浓HCL约42ml，定容至1L，高压灭菌，室温保存。3.2Westernblot电泳、转膜及显色过程3.2.1清洗将玻璃板洗净，用ddH2O冲洗，然后晾干。封板时保证支架与底座胶条契合，固定时两边同时均匀用力旋动齿轮把手，固定即可，不要用力过大以免压碎玻璃。封好后可装ddH2O试试，确定不漏后再灌胶。2、制胶①SDS-PAGE分离胶配方表（12%Gel）各种组分名称各种凝胶体积对应的各种组分的取

6、样量(ml)10ml15ml20mlH2O3.34.96.630%Acrylamide4.06.08.01.5MTris-Hcl(pH8.8)2.53.85.010%SDS0.10.150.210%过硫酸铵（AP）0.10.150.2TEMED0.0040.0060.008②SDS-PAGE浓缩胶（5%Acrylamide）配方表各种组分名称各种凝胶体积对应的各种组分的取样量(ml)4ml5ml6mlH2O2.73.44.130%Acrylamide0.670.831.01.0MTris-Hcl(pH6.8)0

7、.50.630.7510%SDS0.040.050.0610%过硫酸铵（AP）0.040.050.06TEMED0.0040.0050.0063、封胶①按前面方法配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。②当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了（至少等30-40min）。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上

8、层水并用吸水纸将水吸干。③按前面方法配5%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。4、拔梳子灌好浓缩胶，约40-60min凝胶后均匀用力拔除梳子，若上样孔有变形，可用适当