蛋白免疫印迹杂交

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1、蛋白免疫印迹杂交（WesternBlot）技术手册·蛋白免疫印迹杂交（WesternBlot）技术手册 蛋白免疫印迹杂交（WesternBlotWB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。本指南讨论WesternBlot操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。   A蛋白样本提取制备     1细胞或组织裂解     2蛋白酶和磷酸酶抑制剂     3蛋白定量     4电泳

2、上样样品的准备B 电泳  1PAGE胶的制备 2蛋白分子量Marker 3阳性对照 4内参对照 5上样与电泳C 转膜与显色（WesternBlot） 1胶中蛋白的检测 2蛋白转膜 3膜上蛋白的检测：丽春红 4膜的封闭 5一抗的孵育 6二抗的孵育7显色 D常见问题分析与解决方案 附录1 WB实验试剂配制方法附录2 SDS-PAGE胶的配制                       WB概述: 检测原理:  A蛋白样本提取制备  蛋白样品制备是WesternBlotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，  总

3、体原则和注意事项：  1：尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）2：保持蛋白的处于溶解状态（通过裂解液的PH盐浓度表面活性剂、还原剂等的选择）3：提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）4：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）5：样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。 A-1细胞或组织裂解      A-1-1细胞裂解       裂解液Lysisbuffer或商品化蛋白

4、抽提试剂盒的选择*目的蛋白分布定位推荐裂解液Lysisbuffe推荐试剂盒全细胞NP-40orRIPA（附录1）全蛋白抽提试剂盒细胞质（可溶蛋白）Tris-HCl（附录1）胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒线粒体蛋白提取试剂盒细胞质（细胞骨架等不溶蛋白）Tris-Triton（附录1）蛋白分级抽提试剂盒细胞质（磷酸化蛋白） 磷酸化蛋白抽提试剂盒细胞膜NP-40orRIPA（附录1）膜蛋白抽提试剂盒蛋白分级抽提试剂盒细胞核RIPA（附录1）核蛋白抽提试剂盒线粒体RIPA（附录1）线粒体蛋白抽提试剂盒亚细胞定位蛋白抽提试剂盒细

5、胞裂解操作方法：1 培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（种类与量见本节2）2 吸净PBS，加入预冷的裂解液，（(1mlper107cells/100mmdish/150cm2flask;0.5mlper5x106cells/60mmdish/75cm2flask).3 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中，4        4℃摇动30min5        4℃离心12,000rpm，20min（根椐细胞种类不同调整离心力）6 轻轻吸取上清，转移至新

6、预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀. A-1-2组织裂解 1 用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，  2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C，3 每约5mg加入约300μl预冷的裂解液lysisbuffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1mg/ml,理想的蛋白浓度应为1-5mg/ml).4 4℃离心12,000rpm，20min，轻轻吸取上清

7、，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀, A-2蛋白酶和磷酸酶抑制剂 推荐购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL，或按下表配制： 备注：其中Sodiumorthovanadate配制活化方法如下：  所有步聚均需在通风橱中进行：1.用双蒸水配制100mM正矾酸钠溶液.2.用盐酸HCl调至pH9.03.煮沸至溶液无色,尽量减少水分挥发.4.冷却至室温5.再调pH至9.06.再煮沸至无色7.重复上述过程,直至溶液煮沸冷却后达pH9.08.用水定容至原体积9.分装保存于-20°C.溶

8、液变黄则弃之不用. A-3 蛋白定量Bradford法Lowry法或BCA法（均有商品化试剂盒可选择，操作简单、需分光光度计或酶标仪），小牛血清白蛋白(BSA)作为标准曲线。如果裂解液中有NP40或其它表面活性剂，则推荐使用BCA法。三种方法或产品比较列表如下：方法原理灵敏性干扰因素应用Lowry法Folin－酚试剂法蛋白质在碱性溶液中肽键与Cu2+螯合，形