蛋白免疫印迹杂交技术手册

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1、蛋白免疫印迹杂交（WesternBlot）技术手册蛋白免疫印迹杂交（WesternBlot.WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。本指南讨论WesternBlot操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。A蛋白样本提取制备1细胞或组织裂解2蛋白酶和磷酸酶抑制剂3蛋白定量4电泳上样样品的准备B电泳1PAGE胶的制备2蛋白分子量Marker3阳性对照4内参对照5上样与电泳C转膜与显色（WesternBlot）1胶中蛋白的检测2蛋白转膜3膜上蛋白的检测：

2、丽春红4膜的封闭5一抗的孵育6二抗的孵育7显色D常见问题分析与解决方案附录1WB实验试剂配制方法附录2SDS-PAGE胶的配制2WB概述:检测原理WesternBlot过程示意图转膜封闭孵育1小时或过夜聚丙烯酰胺凝胶电泳孵育一抗孵育1小时或过夜孵育酶标二抗1小时洗膜3×5min/1×10min孵育底物（如为显色法，则直接孵育至显色即可）1min胶片曝光显影1-30min2A蛋白样本提取制备蛋白样品制备是WesternBlotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项：1：尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）2：

3、保持蛋白的处于溶解状态（通过裂解液的PH盐浓度表面活性剂、还原剂等的选择）3：提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）4：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）5：样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。A-1细胞或组织裂解A-1-1细胞裂解裂解液Lysisbuffer或商品化蛋白抽提试剂盒的选择*目的蛋白分布定位推荐裂解液Lysisbuffer推荐试剂盒全细胞NP-40orRIPA（附录1）全蛋白抽提试剂盒细胞质（可溶蛋白）Tris-HCl（附录1）胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒线粒体蛋白提取试剂盒细胞质（细胞

4、骨架等不溶蛋白）Tris-Triton（附录1）蛋白分级抽提试剂盒细胞质（磷酸化蛋白）磷酸化蛋白抽提试剂盒细胞膜NP-40orRIPA（附录1）膜蛋白抽提试剂盒蛋白分级抽提试剂盒细胞核RIPA（附录1）核蛋白抽提试剂盒线粒体RIPA（附录1）线粒体蛋白抽提试剂盒亚细胞定位蛋白抽提试剂盒细胞裂解操作方法：1.培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（种类与量见本节2）；2.吸净PBS，加入预冷的裂解液，（1mlper107cells/100mmdish/150cm2flask;0.5mlper5x106cells/60mmdish/75cm2flask）；3.用细胞刮

5、子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中；4.4℃摇动30min；5.4℃离心12,000rpm，20min（根椐细胞种类不同调整离心力）；6.弃沉淀，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本；A-1-2组织裂解1用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解；2将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C；133每约5mg加入约300μl预冷的裂解液lysisbuffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1mg/m

6、l,理想的蛋白浓度应为1-5mg/ml)；44℃离心12,000rpm，20min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀。A-2蛋白酶和磷酸酶抑制剂推荐购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL，或按下表配制：备注：其中Sodiumorthovanadate配制活化方法如下：  所有步聚均需在通风橱中进行：1.用双蒸水配制100mM正矾酸钠溶液；2.用盐酸HCl调至pH9.0；3.煮沸至溶液无色,尽量减少水分挥发；4.冷却至室温；5.再调pH至9.0；6.再煮沸至无色。7.重复上述过程,直至溶液煮沸冷却后达pH9.0；8.用水定容至原体积；9.

7、分装保存于-20°C.溶液变黄则弃之不用。13A-3蛋白定量Bradford法Lowry法或BCA法（均有商品化试剂盒可选择，操作简单、需分光光度计或酶标仪），小牛血清白蛋白(BSA)作为标准曲线。如果裂解液中有NP40或其它表面活性剂，则推荐使用BCA法。三种方法或产品比较列表如下：方法原理灵敏性干扰因素应用Lowry法Folin－酚试剂法蛋白质在碱性溶液中肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，还原酚磷