第十二章 印迹杂交技术

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1、第十二章印迹杂交技术Molecularhybridization印迹技术(blot)——指将电泳分离的样品（核酸或蛋白质）从凝胶转移到印迹膜上，然后与标记探针进行杂交来检测样品的方法。•印迹法分类：SouthernBlotDNA印迹NorthernBlotRNA印迹WesternBlot蛋白质印迹（免疫印迹）EasternBlotWesternBlot的一种变形第一节核酸杂交的基本概念温度、酸碱、有机溶剂、尿素等核酸变性：在某些理化因素作用下，核酸分子互补双链之间氢键断裂，使双螺旋结构松散变成单链的过程。DNA变性：在变性因素作用下，DNA分子互补双链之间氢键断裂，使双螺旋结构解

2、开成两条单链的过程。DNA复性（renaturation）：在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象。退火（annealing）：热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性。DNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性引起紫外吸收值的改变DNA的紫外吸收光谱•增色效应：核酸在变性过程中260nm波长吸收值（A260）增加•减色效应：核酸在复性过程中260nm波长吸收值（A260）减小DNA加热50%DNA发生变性此时的温度——解链温度（meltingtemperature,Tm）G—C百分含量与Tm的关系核酸分子杂交单链的核酸分子在合适条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成

3、杂化双链的过程。•核酸分子杂交可在DNA与DNA、DNA与RNA、RNA与RNA的两条单链间进行。核酸分子杂交的体系液相杂交：待测核酸和探针均游离于溶液。固相杂交（常用）：将待测核酸（或探针）固定于固相支持物，然后与溶液中的游离探针（或待测核酸）进行杂交，形成的杂交体结合于固相支持物上。第二节核酸探针与标记探针(probe)——能与待测的分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子（带有标记物）。•探针的检测对象：核酸、蛋白质、细胞结构等。•除核酸探针外，探针利用抗体-抗原、配体-受体等相互作用的原理与靶分子结合。一、核酸探针——带有标记物且序列已知的核酸片段，能与待测核酸中的

4、特定序列特异杂交。•核酸探针是否合适是决定核酸杂交分析能否成功的关键。核酸杂交与分子探针核酸探针应具有的条件①特异性高：只与待测核酸样品中的互补序列杂交。②带有标记物：标记物灵敏度高而稳定，检测方便。核酸探针的种类基因组DNA探针cDNA探针RNA探针寡核苷酸探针基因组DNA探针•直接从基因组文库中筛选后、酶切制备；或用PCR扩增基因组中的目的基因制备。•包含目的基因的全部序列或部分序列，是最常用的DNA探针。•优点：制备简便；不易降解；标记方法成熟。•注意：尽可能用基因的编码顺序（外显子）作为探针。cDNA探针优点：mRNA逆转录而来，不含内含子等非编码区，特异性高；适用于

5、研究基因表达。缺点：获取过程复杂，不易制备RNA探针①是单链探针，所以不会自身退火，与待测核酸的杂交效率较高，杂交体稳定性更好②不含高度重复序列，非特异性杂交也较少③杂交之后可以用Rnase将未杂交的游离RNA探针降解，从而降低本底干扰④缺点：容易降解寡核苷酸探针①根据已知核酸序列人工合成的DNA探针；或根据基因产物氨基酸序列推导合成。②复杂程度低，故杂交所需时间短；③是单链DNA探针，不会自身退火；④长度一般为17～50nt，只要其中有一个碱基不配对就会影响杂交，可用于分析点突变。⑤缺点：不如长的杂交核酸分子稳定。所带标记物较少，特别是非放射性标记时，灵敏度较低。因此当用于单拷贝基

6、因的Southern印迹杂交时，以采用较长的探针为好。核酸探针的选择①多数情况（DNA探针）②靶序列单个碱基改变，如SNP分析（寡核苷酸探针）③复杂的靶核苷酸序列和病原体（特异性较强的长的双链DNA探针）④组织原位杂交（寡核苷酸探针、短的PCR标记探针（80~150nt）——易透过细胞膜）⑤基因表达水平（长的核酸探针，可达300nt）二、核酸探针标记物分类：放射性标记探针非放射性标记探针1.放射性同位素——应用广泛，以32P应用最普遍，放射自显影；此外，还有3H、35S。优点：灵敏度高；缺点：放射性污染，半衰期短、不稳定等。32P：产生β射线，灵敏度高，分辨率强，是最常用的放射性标记

7、物，但半衰期短（14.3天）：α位和γ位标记。35S：分辨率高、半衰期长（87.1天）敏感度低2.非放射性标记物优点：无环境污染，可长时间贮存。•生物素：一种小分子水溶性维生素，连接在碱基上和抗生物素蛋白（avidin）特异结合抗生物素蛋白上连接有显色物质(酶、荧光素等)。•酶促显色：碱性磷酸酶（ALP或AKP）：催化底物（5-溴-4-氯-4吲哚磷酸，BCIP）和硝基蓝四氮唑（NBT），生成不溶性紫色化合物二甲臜；辣根过氧化物酶（HRP）：催化底物二氨