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时间:2019-06-20
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1、第十二章印迹杂交技术Molecularhybridization印迹技术(blot)——指将电泳分离的样品(核酸或蛋白质)从凝胶转移到印迹膜上,然后与标记探针进行杂交来检测样品的方法。•印迹法分类:SouthernBlotDNA印迹NorthernBlotRNA印迹WesternBlot蛋白质印迹(免疫印迹)EasternBlotWesternBlot的一种变形第一节核酸杂交的基本概念温度、酸碱、有机溶剂、尿素等核酸变性:在某些理化因素作用下,核酸分子互补双链之间氢键断裂,使双螺旋结构松散变成单链的过程。DNA变性:在变性因素作用下,DNA分子互补双链之间氢键断裂,使双螺旋结构解
2、开成两条单链的过程。DNA复性(renaturation):在适当条件下,变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象。退火(annealing):热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性。DNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性引起紫外吸收值的改变DNA的紫外吸收光谱•增色效应:核酸在变性过程中260nm波长吸收值(A260)增加•减色效应:核酸在复性过程中260nm波长吸收值(A260)减小DNA加热50%DNA发生变性此时的温度——解链温度(meltingtemperature,Tm)G—C百分含量与Tm的关系核酸分子杂交单链的核酸分子在合适条件下,与具有碱基互补序列的异源核酸形成
3、杂化双链的过程。•核酸分子杂交可在DNA与DNA、DNA与RNA、RNA与RNA的两条单链间进行。核酸分子杂交的体系液相杂交:待测核酸和探针均游离于溶液。固相杂交(常用):将待测核酸(或探针)固定于固相支持物,然后与溶液中的游离探针(或待测核酸)进行杂交,形成的杂交体结合于固相支持物上。第二节核酸探针与标记探针(probe)——能与待测的分子发生特异性相互作用,并可被特殊的方法探知的分子(带有标记物)。•探针的检测对象:核酸、蛋白质、细胞结构等。•除核酸探针外,探针利用抗体-抗原、配体-受体等相互作用的原理与靶分子结合。一、核酸探针——带有标记物且序列已知的核酸片段,能与待测核酸中的
4、特定序列特异杂交。•核酸探针是否合适是决定核酸杂交分析能否成功的关键。核酸杂交与分子探针核酸探针应具有的条件①特异性高:只与待测核酸样品中的互补序列杂交。②带有标记物:标记物灵敏度高而稳定,检测方便。核酸探针的种类基因组DNA探针cDNA探针RNA探针寡核苷酸探针基因组DNA探针•直接从基因组文库中筛选后、酶切制备;或用PCR扩增基因组中的目的基因制备。•包含目的基因的全部序列或部分序列,是最常用的DNA探针。•优点:制备简便;不易降解;标记方法成熟。•注意:尽可能用基因的编码顺序(外显子)作为探针。cDNA探针优点:mRNA逆转录而来,不含内含子等非编码区,特异性高;适用于
5、研究基因表达。缺点:获取过程复杂,不易制备RNA探针①是单链探针,所以不会自身退火,与待测核酸的杂交效率较高,杂交体稳定性更好②不含高度重复序列,非特异性杂交也较少③杂交之后可以用Rnase将未杂交的游离RNA探针降解,从而降低本底干扰④缺点:容易降解寡核苷酸探针①根据已知核酸序列人工合成的DNA探针;或根据基因产物氨基酸序列推导合成。②复杂程度低,故杂交所需时间短;③是单链DNA探针,不会自身退火;④长度一般为17~50nt,只要其中有一个碱基不配对就会影响杂交,可用于分析点突变。⑤缺点:不如长的杂交核酸分子稳定。所带标记物较少,特别是非放射性标记时,灵敏度较低。因此当用于单拷贝基
6、因的Southern印迹杂交时,以采用较长的探针为好。核酸探针的选择①多数情况(DNA探针)②靶序列单个碱基改变,如SNP分析(寡核苷酸探针)③复杂的靶核苷酸序列和病原体(特异性较强的长的双链DNA探针)④组织原位杂交(寡核苷酸探针、短的PCR标记探针(80~150nt)——易透过细胞膜)⑤基因表达水平(长的核酸探针,可达300nt)二、核酸探针标记物分类:放射性标记探针非放射性标记探针1.放射性同位素——应用广泛,以32P应用最普遍,放射自显影;此外,还有3H、35S。优点:灵敏度高;缺点:放射性污染,半衰期短、不稳定等。32P:产生β射线,灵敏度高,分辨率强,是最常用的放射性标记
7、物,但半衰期短(14.3天):α位和γ位标记。35S:分辨率高、半衰期长(87.1天)敏感度低2.非放射性标记物优点:无环境污染,可长时间贮存。•生物素:一种小分子水溶性维生素,连接在碱基上和抗生物素蛋白(avidin)特异结合抗生物素蛋白上连接有显色物质(酶、荧光素等)。•酶促显色:碱性磷酸酶(ALP或AKP):催化底物(5-溴-4-氯-4吲哚磷酸,BCIP)和硝基蓝四氮唑(NBT),生成不溶性紫色化合物二甲臜;辣根过氧化物酶(HRP):催化底物二氨
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