southern印迹杂交基本方法及主要步骤.doc

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1、基本概念及原理　　Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量[1][2]。基本方法及主要步骤　　Southern印迹杂交的基本方法包括四部分，以下以植物southern印迹杂交为例。　　（1）植物基因组DNA提取；　　（2）DNA的限制性内切酶酶解、电泳和Southern转移；　　（3

2、）探针的标记和纯化；　　（4）杂交、洗膜、检测以及去除膜上探针。　　主要操作步骤：　　1．琼脂糖电泳　　（1）取一定量的待测DNA样品，用适当的限制性内切酶酶切。DNA的量根据样品的种类及实验目的的不同而异，对于克隆片段的限制性内切酶图谱分析，取0.1-0.5μg即可；而对于鉴定基因组DNA中的单拷贝基因序列，则需要10～20μg；当采用寡核苷酸探针或探针的比放射性活性较低时，则需要30～50μg。　　（2）酶切完毕，在琼脂糖凝胶中电泳。　　（3）电泳结束后，EB染色，长波紫外线下观察电泳结果及照相。　　2．印迹转移　　（1）切胶并作标记（左下角切除

3、），以便于定位，然后将凝胶置于一容器中。　　Southern印迹杂交转膜示意图（2）将凝胶浸泡于适量的变性液中，室温下放置1h使之变性，不间断地轻轻摇动。变性缓冲液：1.5mol/LNacl0.5mol/LNaOH　　（3）将凝胶用去离子水漂洗1次，然后浸泡于适量的中和液中30min，不间断地轻轻摇动。更换中和液，继续浸泡15min。　　（4）将滤纸，硝酸纤维素膜NC膜(以下简称NC膜）剪成与胶同样大小，NC膜浸入转移buffer中平衡30min。　　（5）按右图操作：逐层铺平，各层之间勿留有气泡和皱折。（6）虹吸转移12-16h。转膜液：1.0mo

4、l/LNacl0.4mol/LNaOH3．固定DNA碱性转移不需要固定，在中性缓冲液中室温15分钟。(1.0mol/LNacl0.5mol/LTris-Cl1　　)（1）取出转移后的NC膜，用滤纸吸干NC膜，NC膜光面朝上平铺于变性液中变性5min。　　（2）用相同的方法将NC膜平铺在中性液上，中和两遍，每遍5min。　　（3）将膜夹在两张干燥滤纸间，80℃烘烤1-2h。　　4．预杂交　　（1）将膜浸入5×SSC中2min，将膜放入干净的塑料袋中。　　（2）将预杂交液事先在65℃预热，然后将10ml预杂交液加入袋中，封口。　　（3）65℃预杂交1h以

5、上，不时摇动。　　5．杂交　　（1）取出杂交袋，剪去一角去除杂交液后，加入5ml杂交液及5μl变性探针，排除气泡后封口。　　（2）将杂交袋放入65℃水中杂交过夜。　　6．按下列条件洗膜（1）剪开杂交袋，用镊子取出膜，放入装有20mL的2×SSC0.1%SDS溶液的平皿中，在室温下振荡洗涤两次，每次5分钟。（2.）用镊子将膜转入0.1×SSC，0.1%SDS溶液(先放50℃水浴预热)中，50℃水浴振荡洗涤两次，每次15分钟。（3）用镊子将膜取出转入装有20mL洗涤缓冲液的平皿中振荡洗涤5分钟。7．信号检测（１）所需试剂：请按下表组分准备所需试剂。溶液组

6、分/制备洗涤缓冲液0.1M顺丁烯二酸,0.15MNaCl;pH7.5(20°C);0.3%(v/v)Tween-20顺丁烯二酸缓冲液0.1M顺丁烯二酸,0.15MNaCl;用NaOH调节到pH7.5(20°C)检测缓冲液0.1MTris-HCl,0.1MNaCl,pH9.5(20°C)TE-缓冲液10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0（２）制备试剂盒工作液溶液组分/制备阻断液用顺丁烯二酸缓冲液1:10稀释10×阻断液，制备成1×工作液。抗体溶液每次使用前，需10,000rpm离心抗Dig-AP酶结合物5分钟，从表面小心吸取所需的量。用阻

7、断液按1:5000稀释抗体。显色底物液加200ulNBT/BCIP到10ml检测缓冲液中。（３）流程：在培养皿上进行信号检测。注意:所有孵育过程应在15-25°C下搅动进行，如果膜要用于再杂交，则不要让膜在任何时候变干。步骤操作1在杂交和严谨洗涤后，在洗涤缓冲液中浸润1-5分钟。2在30ml阻断液中孵育30分钟。3在10ml抗体液中孵育30分钟。4用30ml洗涤液洗涤2x15分钟。5在15ml检测缓冲液中平衡2-5分钟。6在避光条件下，于10ml新鲜制备的显色底物液中反应显色。在显色过程中勿摇动。注意:在几分钟内即有颜色开始沉淀，并在16h后完成反应

8、。为检测显色程度，膜可以短时间暴露于光线下。7当达到所需的点或带强度后，用50ml双蒸水或TE-缓冲液将膜漂