southern杂交实验方法和步骤

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1、southern杂交实验方法和步骤一、主要仪器：离心机恒温水浴锅Orbitalshaker恒温摇床PonerPAC300核酸电泳仪VersaDoc凝胶成像系统水平摇床HL-2000Hybrilinker分子杂交仪烘箱二、主要材料whatman3mm滤纸尼龙膜吸水纸玻璃板玻璃棒废旧胶片方形果盘平板三、主要试剂RNaseA真菌基因组提取试剂盒DIG-HighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitIDNAMakerNaOH，NaCl，浓盐酸，Tris碱，柠檬酸钠，马来酸四、试剂准备变性液：0.5m

2、ol/LNaOH，1.5mol/LNaCl；Southernblot中和液：0.5mol/LTris-HCl（pH=7.5），1.5mol/LNaCl；20×SSC：3mol/LNaCl，0.3mol/L柠檬酸钠，浓盐酸调节pH至7.0；2×SSC：取100mL20×SSC溶液，灭菌去离子水定容至1L；2×SSC+0.01%SDS：取100mL20×SSC溶液，10mL10%SDS，灭菌去离子水定容至1L；0.5×SSC0.01%SDS：取25mL20×SSC溶液，10mL10%SDS，灭菌去离子水定容至1L；洗涤缓冲液：0.1

3、M马来酸，0.15MNaCl，pH7.5，0.3%（v/v）Tween20；马来酸缓冲液：0.1M马来酸，0.15MNaCl，用NaOH（固体）调节pH值至7.5；检测缓冲液：0.1Tris-HCl，0.1MNaCl，pH9.5；威斯腾生物400-675-6758封阻溶液：将DIG试剂盒内的6号瓶置于37℃水浴锅中预热，充分溶解后，取12mL，与108mL马来酸缓冲液混匀备用（新鲜配制，立即使用）；抗体溶液：将DIG试剂盒内的4号管10000rpm高速离心5min，取4µL上清，加入20mL封阻溶液中，备用；底物显色液：取20m

4、L检测缓冲液，避光加入400µLDIG试剂盒内的5号管。五、实验安排确定实验样本，查找序列，进行酶切位点及探针设计，并合成引物；培养样本，配制杂交所用试剂，PCR探针合成，回收，质量检测，DIG标记探针；提取样本基因组，检测基因组质量，酶切预实验；正式酶切，电泳，转膜；烘干固定，预杂交，杂交过夜；洗膜，显色。六、大量真菌基因组的提取取绿僵菌孢子接种于20mL的1/4SDAY培养液中，250rpm×28℃培养2d；抽滤收集菌丝，灭菌水冲洗3次以上；将抽滤的菌丝加液氮速冻后研磨成粉末，研磨3次以上，取约500mg粉末至2mL的离心管

5、中，按照真菌基因组提取试剂盒的方法步骤依次进行操作：①加入400μL的LEBuffer，震荡使其充分混匀，再加入4μL的100mg/mL的RNaseA，混匀，置于65℃水浴锅中温浴半小时；②加入130μLDABuffer，混匀后冰浴5min后14000g高速离心3min；③将离心后上清转移到新的1.5ml的PE管中，加入750μLEBindingBuffer，充分混匀，将混合液体转移到Spincolum中，6000g离心1min，弃去管中液体；④向Spincolum中加入500μLGBindingBuffer，10000g高速离

6、心30s，弃去管中液体；⑤向Spincolum中加入600μLWashBuffer，10000g高速离心30s，弃去管中液体；⑥重复上一步；⑦再次将Spincolum于10000g高速离心1min，并将Spincolum放置在一个新的1.5ml离心管上；⑧室温静置3min，向Spincolum中加入40μL灭菌去离子水，室温放置1min，12000g高速离心1min。检测提取得到的基因组的质量和浓度。威斯腾生物400-675-6758七、Southernblot验证敲除转化子①基因组酶切：将敲除转化子和野生型菌株的基因组用X1和

7、X2双酶切，反应体系如下：10×FDbuffer4.5μlX12μlX22μl样品DNA6μgddH2O水至45μl总体积45μL37℃恒温反应2h。②电泳分离酶切1.5h后，取2μL酶切DNA样品于1%的琼脂糖凝胶上进行检测，判断酶切程度。当酶切充分时，制备1%的琼脂糖电泳凝胶，样品中加入10×loadingbuffer，于30-40V稳压电泳4-5h（包括DNAMarker和阳性对照质粒），电泳完成之后，切下样品及质粒部分的凝胶，剩余DNAMarker部分则单独浸泡在添加了10μL10mg/ml溴化乙锭（EB）的100mL1

8、×TAEbuffer中染色30min。③电泳凝胶预处理1)将凝胶浸于适量变性液中（浸没凝胶），室温，于水平摇床上低速晃动15min，并重复一次；2)再将凝胶浸于灭菌的ddH2O中，室温，轻轻晃动10min；3)将凝胶浸在中和液中，室温轻轻晃动15min，并重复一