southern印迹杂交实验报告

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1、Southern印迹杂交实验报告姓名：陆叶学号：14211020062专业：公共卫生实验时间：12.18；12.25带教老师：潘銮凤【实验目的】学习核酸杂交的基本过程和操作【实验原理】将待检测的DNA分了川或不川限制性内切酶消化P，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶屮的位H转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或-K它标记物标记的DNA或RNA探针进行反庖，检测靶DNA片段屮是否存在与探针同源的序列。如果待检物中含冇与探针互补的序列，则二者通过碱锥互补的原理进行结介，游离探针

2、洗涤后用A.W.影或其它合适的技术进行检测，从而敁示!11待检的片段及其相对大小。用途：检测样品巾的DNA及其含量，了解基因的状态，如是否有点突变、扩增重排等。【实验步骤】1、基因组DNA的限制性內切酶酶切取1个1.5ml离心管按下列S依次加入菽因组DNA、10X酶缓冲液，酶，做好标记。老师给的HL60基因组DNAlOug（7.6UL）;lOxBufferE（10.4uL）；EcoRI（IOu/pL）（2uL）。总体积20ULo37'C保温1.5小吋。2、1°%琼脂糖电泳先制备凝胶，称取1.2gAgar

3、ose放入三角烧瓶屮，加入60mLTAE溶液，微波炉屮加热令完全溶解，稍作冷却后加入GelRed核酸染液6uL（稀释10,000倍）。浇板，水平放置，待凝。胶凝后按照以下顺序加样。两组共用一块凝胶，共7个样。①基因组DNA1020UI（自己的）②基因组DNA10Ug（老师的）③酶切样品④阳性对照（c-myc4.7kb线性片段，30pg/p1,10UI）⑤酶切样品⑥基因组DNA10Pg（老师的）⑦基因组DNA1020UI（&己的）插上电源，负极在样品槽一边，DNA将向阳极跑，80V电泳2小吋左右，直到溴酚

4、蓝染料跑到接近凝胶尾部，在电泳期间做好胶变性和转移准备。3、变性切胶，2—6孔，宽4.5cm,长7cm（从顶部开始，可用尼龙膜保护纸作为标尺）①将凝胶浸在5倍体积的胶变性液中，慢慢摇动20分钟。②ddH20洗2次。③在胶中和液中慢慢摇动15分钟。4、转移①在搪瓷盘中加入300mll0XSSC,放上培养皿和小玻璃板。②将3张长滤纸浸湿，逐张放在玻璃板上，用移液管的滚动，赶走气泡。③切除多余凝胶，小心地将凝胶放在滤纸上（加样孔而^卜），赶走滤纸与胶之M的气泡。④再将与胶人小相同的尼龙膜（沒湿）放在胶上，同样

5、不能有气泡，然后放上三张浸浞的滤纸，赶走气泡。⑤紧贴凝胶网周各放一张X光片。⑥小心蒙上一张比搪瓷盘人的保鲜膜。保鲜膜要紧贴滤纸，佴不能让滤纸移动。①用刀片在离滤纸周围约1-2mm处，轻轻割断保鲜膜，但不能割破滤纸。収走滤纸上的保鲜膜。②整齐地放上草纸，数张草纸-•折为二，草纸堆要高出搪瓷盘边约10cm。③在草纸上放上玻璃板，压上约500g重的重物，转移过夜。5、罔定①将胶和尼龙膜一起翻过來，川铅笔深入加样槽在尼龙膜上画上槽的位置。②正面朝上放在紫外交联仪中，交联固定。6、杂交和洗膜①将尼龙膜放入杂交管内

6、，加预杂交液，68"C封W6小吋。②倒出预杂交液，加杂交液，68°C杂交过夜。③I叫收杂交液（可重复使用），将脱放在洗脱溶液I（2xSSC,0.1%SDS）屮，室温洗2次，每次摇动5分钟。④再在洗膜溶液II（0.5XSSC,0.1%SDS）中,68°C洗2次，每次摇动15分钟。7、检测①将膜在缓冲液1（马來酸缓冲液＞屮漂洗3分钟。②在缓冲液2（封闭液）中室温摇动封闭30分钟。③在含anti-DIG-AP的抗体溶液中室温摇动，孵育30分钟。④用洗胶溶液III（马来酸缓冲液，0.3%吐温）洗2次，每次15分

7、钟。⑤在缓冲液3（检测缓冲液）中平衡3分钟。⑥将膜与新鲜配制的显色溶液一起在黑暗中溫育0.5-16小时。⑦当条带显色到合适的深度或在脱背景变深前，用TE或ddH2O洗去底物液，拍照井干燥保存。【实验结果】上面两张图分别为琼脂糖凝胶电泳结果和Southernblot结果，琼脂糖凝胶电泳结果显示1-3条带（基因组DNA自己的；基因组DNA老师的；酶切样品）均有DNA什段显示，4阳性对照对应条带无DNA八段显示，1、2条带因为菽因组很大，在电场作用下基本不会动，故在靠近加样孔的地方；而酶切厂；的基因组由于断裂

8、成•一系列的片段，电泳时会形成均匀的涂抹状，见条带3:尾巴高亮怀疑是RNA量过多；Southernblot只显示了阳性对照结果。【注意事项】1、DNA限制性酶的用量l-5U/ugDNA，时间为1-20小时。中途可取少量（小于十分之一）电泳检测足否酶切完全。2、EDTA会抑制酶活性，迕酶解反应液中的浓度小于0.25mmol/l为佳。3、内切酶一般保存在U*油中，U*油会抑制酶活性，因此，所加入酶的体积应小于反应总体积的十分之一，否则应将反应体