Southern Blot操作流程

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1、SouthernBlot操作流程1、哺乳动物基因组DNA的提取（或用OMEGA试剂盒E.Z.N.A.TMTissueDNAKit）1、取约30mg样品，加入600ulSNET，再加入12ul（20.2mg/ml）的蛋白酶K，使蛋白酶K的终浓度为400ug/ml；2、55℃振荡过夜；3、加入0.6ulRNaseA，室温下孵育10min，后置于65℃10min；4、加入300ulTris饱和酚，288ul氯仿和12ul异戊醇，室温下振荡30min；5、17,000g离心5min，转移上层水相（600ul）至一新的离心管；6、加入等体积

2、（600ul）的异丙醇沉淀DNA，于4℃下13,250g离心15min；7、小心除去异丙醇，加入1ml70%的乙醇。离心5min后除去乙醇，室温下干燥15~20min；8、加入100ulTE，使核酸沉淀溶解。一、酶切1、拷贝数的计算哺乳动物基因组全长3.0×109个碱基对，按插入基因单拷贝计算如下：2、酶切体系基因组DNA10ug10*Buffer10ul酶(10U/ul)10ulTotal100ul3、混合后置于适宜酶切温度进行酶切反应；4、对酶切产物进行纯化，用30ulTE洗脱；1、制备1%浓度的琼脂糖凝胶（不加EB）；2、将

3、纯化后的酶切产物敞开盖子于70℃放置15min，以除尽残留乙醇和消除酶切后产生的粘性末端；3、电泳：1v/cm。一、转膜1、碱变性：把胶条转移到含碱变性液的器皿中，摇床处理15min；重复一次；2、中和：倒出器皿中的碱变性液，加入中和液，摇床处理15min；重复一次；3、倒出中和液，加入20×SSC，摇床处理15min；4、转膜：1）在一干净的容器中放入一包吸水纸，倒入20×SSC，浸湿；2）放上一张与胶条大小相当的sigma3M滤纸，倒上一层20×SSC，防止产生气泡；3）将预先剪裁好的尼龙膜放入ddH2O中充分浸润2分钟；4）

4、小心把胶条铺在滤纸上面，用玻璃棒擀平，赶走气泡；5）往胶上倒上一层20×SSC，将尼龙膜铺在胶条上，再向上倒上一层20×SSC；6）再放上一张与胶条大小相当的sigma3M滤纸；7）用保鲜膜把胶条四周封上，在上面压上一包吸水纸，再用一个约250mg的物体压在吸水纸上面；8）转膜过夜；5、固定将膜放在用10×SSC浸湿的滤纸上面，使含DNA面朝上，放入紫外交联仪中，以1.5J，254n，2.5min的程序将DNA固定在尼龙膜上。二、杂交1、标记探针：可用随机引物法或PCR方法标记探针；2、将尼龙膜有DNA的一面朝内，卷成筒状放入杂交

5、管中，加入10ml经预热至50℃的DIGEasyHyb，于50℃预杂交30min；3、取10ul经标记的探针，热水浴5min变性，然后迅速放入冰水混合物中；4、将变性后的探针加入4ml预热的DIGEasyHyb中，混匀，并防止气泡的产生（气泡会产生背景）；1、倒出预杂交液，加入含探针的杂交液，杂交4h或过夜。2、杂交温度的计算Tm=49.82+0.41（%G+C）-（600/I）[I=lengthofhybridinbasepairs]Topt=Tm-20to25℃一、洗膜1、室温下用W1洗液洗5min，重复一次；2、68℃下用W

6、2洗液洗15min，重复一次；3、将膜用WashingBuffer浸润5min；4、25~50℃下，用100mlBlockingSolution孵育30min，保持摇动；5、25~50℃下，用20mlAntibodySolution孵育30min，保持摇动；6、用100mlWashingBuffer洗15min，重复一次；7、用20mlDetectionBuffer平衡5min；8、将膜放入杂交袋中，使含DNA面朝上，滴加1mlCSPDready-to-use，将杂交袋合上，并赶走气泡，于15~25℃孵育5min；9、挤出多余的液

7、体，将潮湿的膜置于37℃孵育10min，以增强发光反应。二、显影直接用成像系统成像。DNA提取的溶液配制1.Tris-HCl(1mol/L；PH8.0)用800ml蒸馏水溶解12.1gTris碱，加浓HCl（约42ml）调PH至8.0，应使溶液冷却至室温后，方可最后调定PH值，加水定容至1L。高压灭菌。***如果溶液出现黄色，应予以丢弃，并使用质量更好的Tris。2.EDTA（0.5mol/L；PH8.0）186.1gEDTA·Na·2H2O加入800ml水中，用NaOH调节PH至8.0（约需20gNaOH），定容至1L，高压灭菌

8、。***EDTA·Na需在PH接近8.0时才会溶解。3.NaCl(5mol/L)292gNaCl加入800ml水中，定容至1L，高压灭菌。4.SDS（20%，m/v）十二烷基磺酸钠200gSDS加入900ml水中，加热到68℃有助于溶解，定容至1L