southern_blot分析课件

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1、DNA电泳原理：带负电荷的DNA分子在电场中向正极泳动的现象。因所带的电荷、分子量不同，泳动速率不同，可作为分离DNA的方法之一。侧视图俯视图markerlane1lane2（—）（+）方法：制胶0.8%琼脂糖凝胶(0.8g琼脂糖粉+100mlTAE)*均匀加热*加EB(<60℃)*去气泡*冷却拔梳子电泳*2~5V/cm*注意正、负极琼脂糖浓度迁移率与浓度成反比琼脂糖含量％（W/V）线性DNA分离范围（Kb）0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2–32.00.1–2DNA的检测用溴乙锭染色在254nm紫外光下检测，如需

2、回收最好在300nm紫外光下割胶，否则易脱嘌呤而断链，在1cm宽带上可检到10ngDNA。分析通常与已知分子量的标准DNA片段一起电泳，经比较可获知DNA标本大小。如条带拖尾，系加入DNA量太多或凝胶未制好。如分子量小或一片糊状，表示DNA有降解。DNA转移原理：利用毛细管虹吸作用，将分离的DNA片段从琼脂糖凝胶中转移至固体支持膜上。方法：准备材料搭置装置凝胶处理凝胶处理：酸处理碱处理盐处理0.25mol/LHCl0.5mol/LNaOH1.5mol/LNaCl1mol/LTris-Cl(pH7.4)1.5mol/LNaCl时间作用处理溶液10min20min20min

3、脱嘌呤变性中和准备材料：尼龙膜、滤纸、吸水纸*大小与胶等同*平衡于20×SSC搭置装置：*逐层赶气泡*叠放顺序*避免短路吸水纸滤纸尼龙膜凝胶盐桥转移方向20×SSC装置图500g引物标记标记法：随机引物法标记物：地高辛(DIG–dUTP)ATCG(46=4096)5`3`5`3`引物六聚体5`5`变性预杂交、杂交核酸杂交：不同来源、具有同源性的单链核酸分子，按照碱基互补配对，通过氢键连接生成新的DNA-DNA、RNA-RNA或DNA-RNA双链的过程。是分子生物学常用的技术之一。预杂交：封闭非特异位点，降低杂交背景。预杂交杂交溶液预杂交液预杂交液+探针温度37℃37℃时

4、间6hr过夜显色BCIP-（5溴-4氯-3吲哚磷酸）AKP-（碱性磷酸酶）NBT-（氯化四唑氮兰）NBTBCIPAKP残余分子兰紫色沉淀兰紫色沉淀P