Southern-Blot-实验流程(包括原理细节).docx

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1、SouthernBlot实验流程（包括原理/细节）一、DNA的提取人和哺乳动物细胞基因组DNA的分离通常是在有EDTA、Sarkosye等一类去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚、氯仿抽提，经RNase处理和纯化来提取DNA。(1)取单层细胞，经无钙、镁PBS洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，细胞悬液经PBS洗2次,弃上清，取细胞沉淀。(2)加入2ml细胞裂解液(10mMTrisHCL，pH8.0，0.1mol/LEDTA，10mmol/LNaCL，1%SDS)充分混匀，加入蛋白酶K至终浓

2、度为0.5～1g/L、Sarkosye终浓度为0.5%，混匀裂解蛋白呈糊状。(3)50℃水浴2h，转入37℃水浴过夜，次日加入等体积饱和酚，轻轻颠倒混匀，以防止DNA断裂，约3min。12000r/min离心15分钟（室温）(4)取水相，再加入等体积酚/氯仿(1:1),同样颠倒混匀，去除蛋白质12000r/min离心15分钟（室温）(5)再重复步骤(4)，再用等体积酚/氯仿(1:1)抽提一次(6)取水相，再加入等体积氯仿，去除酚及蛋白质，颠倒混匀12000r/min离心15分钟（室温）(7)取水

3、相，加入2倍体积的预冷无水乙醇，沉淀DNA，混匀-20℃放置1小时12000r/min离心15分钟（室温）(8)用70%乙醇洗涤一次，按上法离心将沉淀真空干燥10分钟。(9)加入RNaseA至终浓度100mg/L，37℃水浴消化1小时，消化污染的RNA。(10)加入蛋白酶K至终浓度0.4g/L、Sarkosye至终浓度0.5%，混匀，50℃水浴2小时，加入NaAC至终浓度10mmol/L。(11)用等体积饱和酚各抽提一次，步骤同前。(12)吸上清，加入氯仿/异戊醇(24:1)，按上法再抽一次。(

4、13)取水相，加入2倍体积预冷无水乙醇，-20℃1小时。(14)取沉淀用70%乙醇洗一次，真空干燥10分钟后溶于少量TE中，4℃贮存。Southern对DNA的质量要求比较高，一般来说，高质量DNA样品需具备以下几点：①DNA完整性好；②DNA纯度高；③勿用TE溶解DNA；④DNA浓度不低于0.7ug/ul，杂交需模板DNA约20ug/泳道/次二、引物设计三、DNA检测1、DNA浓度的测定DNA浓度用紫外分光光度计测定，核酸的光吸收值位于波长260nm处，蛋白质则位于280nm，分别测定后，其O

5、D260/OD280的比值应大于1.8.低于此值，说明DNA中仍残留较多的蛋白质，此时可用酚、氯仿继续抽提纯化。若比值大于1.9表明DNA链破坏，断裂严重，已成为小分子，因此操作应轻柔。取少许DNA溶液，经紫外线扫描，吸收峰值位于波长260nm处，其纯度应为OD260/OD280=1.8,OD260值为1的溶液大约含50μg/mLDNA，故DNA的浓度(μg/mL)=OD260值×50μg/mL×稀释倍数。DNA总量(μg)=DNA浓度(μg/mL)×总体积(mL)2、DNA分子量的测定DNA分

6、子量大小测定，可用含溴化乙锭的1%琼脂凝胶电泳法测定，根据加入标准品片断的电泳迁移距离计算样品片断分子量大小，此技术还可用作分离基因组DNA，进一步进行Southern吸印分析。四、探针制备（以PCR标记方法为例）1、标记原理Dig-dUTP在TaqDNA聚合酶的作用下，经基因特异的引物PCR指数扩增，可掺入到新合成的DNA分子中，从而完成DNA探针的标记。在延伸反应中，每20~25个核苷可有一个Dig-dUTP分子掺入到新合成的DNA链中。2、操作步骤1）探针标记注意：在探针标记前，必须用普通

7、PCR优化反应条件（试剂盒中提供了过量的TaqDNA聚合酶及其Buffer，建议用于条件优化），包括引物、退火温度、延伸时间、模板量等，设定好最佳反应条件。任何非特异扩增可能导致高的杂交背景甚至假阳性。在标记反应的同时，用普通dNTP做一个相同体系的非标记PCR扩增。扩增体系：组份D标加量Control加量10×buffer(plusMg2+)2μl2μl1μl000.4μl引物F/R1μl1μl模板1μl1μl1μl1μl14μl14.6μlPCR扩增：95℃5min;[95℃30sec,60

8、℃35sec,72℃30sec;]72℃5min;30cycles2）标记探针检测取标记产物和普通PCR扩增产物各1μl，1.0%的琼脂糖凝胶电泳。由于大分子量的DIG掺入，标记产物泳动速度比普通PCR产物要慢。所以根据电泳图就可以判断是否标记上和有没有非特异标记！其余标记产物-20℃保存。如果要准确检测标记效率（一般不必），取标记产物1μl和Dig标记的对照DNA，用DNA稀释液按10倍系列稀释后点样于带正电荷尼龙膜上。用紫外交联仪或真空烘烤固定DNA探针，按杂交检测方法进行信号检测，然后与膜