southern blot(自总结2)

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1、Southernblot（J版）1.提取植物总DNA(CTAB法)试剂：1)2×CTAB提取缓冲液（低于15℃会析出，加入材料前先65℃预热）0.1mol/LTris-Cl(pH8.0)1.4mol/LNaCl20mmol/LEDTA(pH8.0)20g/LCTAB（2%）20g/LPVP-40（2%）使用前加入2%(体积比)的巯基乙醇。步骤：1)提取前将植物材料在暗处放置24小时，以降低材料的淀粉含量。2)剪取大约1g叶片，置于研钵中，倒入液氮研成粉末（一定研磨细致，非常重要），分装入2ml离心管中（样品约占0.5ml的体积），每管加入900ulCTAB提取缓冲液，温和

2、彻底的混匀，静置，使裂解彻底。3)65℃水浴保温1-1.5小时。4)冷至室温后加900ul酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），充分温和混匀直到叶片粉末由绿转白（水相，酚相混匀成乳状液）。5)室温下13,000rpm离心10min，吸取上层水相。6)取上清（约900ul）再用等体积的氯仿：异戊醇(24：1)再抽提一次。13,000rpm离心10min。7)取上层水相（约700ul），加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA。小心倒出每管中液体，将絮状DNA沉淀收集到一个新的1.5mlEP管中（同一个样品）。8)用70%乙醇洗涤沉淀3-5次，每次将沉淀适当浸泡以充分洗涤，最后一次稍加离

3、心，将洗涤液尽量去除干净，通风橱中晾干约10min左右（不要过分干燥）。81)加200ul灭菌的去离子水（或者TE），并加入2ulRnaseA（10mg/ml），37℃保温30-60min溶解沉淀，充分混匀，并消化RNA。（可直接到第11步）2)（可省步骤）如需做此步骤，则上步中需用700ulddH2O溶解沉淀，37℃保温消化RNA后再用等体积氯仿：异戊醇(24：1)抽提，并离心，取上清。加入1/10体积的NaAC（3M，pH5.2）和2-2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min-1hr，10000rpm离心10分钟。70%乙醇洗涤沉淀3-5次，干燥，用200ulT

4、E溶解沉淀，4℃溶解过夜。3)取2ul走0.7%的琼脂糖凝胶，检测所提DNA的质量。（上样DNA需要充分混匀）4)电泳同时可用紫外分光光度计测量DNA的纯度，浓度（仅参考）。5)选取有代表性的2-3个DNA样品（即电泳显示浓度最大和最小的样品），稀释10倍后用精定量marker进行电泳定量。A260/A280=1.8A260/A230=2-2.52.制备地高辛标记探针（详见kitIIP9）试剂：doubledistilledwater(ddH2O)：稀释DNAEDTA(0.2M，pH8.0)：终止标记反应DIG-HighPrime(kit)：瓶1，防止反复冻融（-20℃保

5、存）A.目的基因探针标记(随机引物法)：20ul体系(1)1ug(至少300ng)模板DNA，用无菌ddH2O稀释到16ul。(2)沸水浴煮10min，立即放入冰中。(3)混匀DIG-HighPrime（瓶1），加4ul到变性DNA中，混匀，稍加离心。(4)37℃反应过夜（约20小时）。(5)加入2ul0.2MEDTA（Ph8.0）或65℃10min终止反应。8A.Marker探针标记(随机引物法)：取3uglDNA/HindIIIMarker，用无菌水将体积补到16ul，沸水浴中煮10min，立即放入冰中。其他同上。探针标记效率的评估（对探针定量）：（KitP12）试剂

6、：lWashingbuffer：洗去未杂交的抗体l马来酸buffer：稀释封闭液l检测buffer（pH9.5）：调节pH值l10×Blockingsolution（kit，瓶6）：用马来酸buffer稀释到1×。（现配现用）lAntibodysolution（kit）：每次使用前需要将anti-digoxigenin-AP（瓶4）以10000rpm离心5min，然后小心从上层取需要量，用blockingsolution以1：10000的比例稀释。eg.可取1ul稀释到10ml。直接检测方法估计探针标记效率：一系列稀释度的DIG标记探针直接点在膜上，同时一系列已知稀释度的

7、DIG标记的对照探针也点在膜上，通过标准检测过程显示出来。（具体操作步骤见Kit）3.酶切植物总DNA的用量一般为5-15mg（例如水稻约为5ug,兰花和烟草约为12-15ug），选用在目的基因内无切点或有单一切点的酶进行酶切。同时切质粒作为正对照，切未转基因的植物材料的总DNA作为负对照。1)酶切体系(以EcoRI切为例)：切200ul体系总DNA150ul(5-15ug)H2O22ulbufferH20ulEcoRI8ul37℃酶切过夜(8-12h)。82)取2ul电泳检测酶切结果。酶切完全的DNA应呈均匀的弥散状。（切记