实验总结-Western blot

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1、WesternBlotWesternBlot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达WB-蛋白提

2、取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采

3、用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（PMSF）。下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶解，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优

4、点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15mol/l浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。（二）有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内不会引起酶的变

5、性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。一、单层贴壁细胞总蛋白的提取：1.倒掉培养液，并将培养皿倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液2.每皿细胞加1ml4℃预冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。3.按1ml裂解液加10μPMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）4.每皿细胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上

6、裂解30min，为使细胞充分裂解培养皿要经常来回摇动。5.裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）6.于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）7.将离心后的上清分装转移倒0.5ml的离心管中放于-20℃保存。二、组织中总蛋白的提取：1.将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。2.加400μ单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。3.几分钟后再

7、碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。4.裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。三、加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：1.将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。2.弃上清，加入4mlPBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS

8、重复洗涤一次。3.用枪洗干上清后，加100μ裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。4.将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃.12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。（可在蛋白浓度测定结束后用SDS稀释蛋白后再保存）WB-BCA蛋白含量测定一、原理：BCA(bicinchoninincacid)与二价铜离子