western-blot实验

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1、Westernblotting检测大肠杆菌重组蛋白1.背景印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称力Southernblotting。之后，JamesAlwine、DavidKemp和GeorgeStark三位教授又发明丫RNA杂交检测技术，因与Southernblotting相似，故命名力Northernblotting。GeorgeStar

2、k这位教授在两年后又开发出类似的蛋白质检测力‘法。1981年，在NealBurnette所者的AnalyticalBiochemistry屮，酋次将单向也泳后的蛋白质分子的印迹分析称力Westernblotting。此后开发的Easternblotting是Westernblotting的变形，对双向也泳后蛋白质分子的印迹分析称力Easternblotting。30年來，Westernblotting技术己成力蛋白质研究巾最常用的工具，川于鉴定目的蛋白是否存在样品当中，蛋白质的表达情况(上调或下调表达)和不同的样品之间的表达差

3、异性。pET系统是在£//中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。T7RNA聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。2.实验目的利用WesternBlotting技术，定性(或定量)检测苦养黄酮醇合酶基因(Flavonolsynthasegene,FtFLS)在大肠杆菌表达宿主菌Evc/7〜BL(DE3)中的诱导表达

4、。3.实验原理黄酮醇合酶(FLS,EC1.14.11.23)属于2-ODD家族，催化黄酮醇合成支路屮最后一步氧化反应，也是直接合成黄酮醇的反应。FLS可以使二氢黄酮醇在C3链屮(32和(33之间氧化形成双键，从而生成黄酮醇：aDihydroflavonol+2-oxoglutarate+O2aFlavonol+succinate+CO2+H2O。本实验采用PCR的方法，在苦荞黄酮醇合酶基因(FtFLS)ORF起始密码子前引入I酶切位点，去掉终止密码并引入I酶切位点。克隆引入酶切位点后的FZFLS到表达载体pET-30b(+)质

5、粒屮，其表达产物分别在N-末端和C-末端各含有6xHis标签。重组质粒(pET-30b⑴-FVfZS)经鉴定后转化表达宿主菌E.⑺//BL21(DE3)并使用IPTG进行诱导表达。收集诱导0h、2h、4h、6h和8h的产物，经SDS-PAGE后用于考马斯亮蓝R-250染色或Westernblotting分析。Westernblotting的标准流程如卜：蛋白质首先通过SDS-PAGE胺凝胶电泳分离，通过电泳转移到固相支持物上(硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜)；将膜上未反应的位点封W起来，以抑制抗体的非特异性吸附，固定的蛋白质

6、即付与特异性的多克隆或单兑隆抗体相互作用并通过放射、生色或化学发光的方法进行定位。本实验采用小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体(Anti-HistagIgG,—抗)与重组FtFLS蛋白的N-末端和C-末端6xHis发生抗原-抗体特异反应，再利用辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(peroxidase-GoatAnti-MouseIgG，二抗)与一抗发生特异结合，最后使用DAB进彳/•显色。DAB即：二氨基联苯胺(3,3'-diaminobenzidine),是过氧化物酶(Peroxidase)的生色底物。DAB在过氧化氢的存在下失去电子而

7、呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。该方法常用于检测过氧化物酶的活性，它灵敏度高，特异性好，在免疫组化，原位杂交，Westernblotting等膜显色中应用广泛。樹1.SDS-PAGE原理示意围图2.Westernblotting原理示意图4.操作步骤4.1样品的制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测大肠杆菌重组蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。材料与试剂：重组pET-30b(+)-F7FLS质粒、表达宿主菌£.⑺//BL21(DE3)、LB固体培养基(

8、Kan50pg/mL)、LB液体培养基(10mL、50mL)、Kan(50mg/mL)、IPTG(24mg/mL)、PBS缓冲液、5XSDS上样缓冲液。仪器与设备：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、洒精灯、消毒酒精(75%)、棉球、接种环、台式离心机、冰盘、Tip(10pL、