Southern步骤

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1、Southern杂交采用Roche公司高辛标记试剂盒进行探针标记并进行SouthernDNA分子杂交。1.基因组的提取：（用SDS-CTAB法提取基因组，并测定OD值）取2μl于0.8%琼脂糖凝胶中，100V，电泳30min，拍照，其余置-20℃保存或直接用于酶切。2.酶切及电泳1)酶切反应体系配制：基因组150~200mg10×限制酶缓冲液50ml限制性内切酶200U灭菌水至总体积500ml混匀体系，37℃过夜酶切。2)酶切产物电泳：将酶切产物沉淀下来，并用50ul水溶解沉淀。制备0.8%琼脂糖凝胶，加5ml10×loadingbuffer到50ml的酶切消化产物中

2、，上样并电泳，35V电泳过夜。3.转膜(1)将凝胶加样孔及不含样品的多余部分切掉，置于0.25MHCl中浸泡10分钟；(2)用蒸馏水稍冲洗后，浸于变性液(0.5MNaOH，1.5MNaCl)中室温变性，15分钟2次共30分钟，其间轻摇数次；(3)用蒸馏水稍冲洗后，浸于中和液(0.5MTris·Cl，pH7.4，1.5MNaCl)中于室温中和15分钟2次共30分钟，其间轻摇数次；(4)洗净转膜仪，选窗口大小合适的封闭膜，剪一张略大于凝胶块的滤纸及尼龙膜，蒸馏水浸润后置于20×SSC中至少5分钟，剪去一角与凝胶块对应铺于底部，后将封闭膜压好，然后将凝胶铺在窗口的尼龙膜上，

3、赶除气泡；(5)真空转移，20×SSC中性转移缓冲液真空转移1.5-2小时，压力5inchHg；4.固定DNA：用UV交联仪（UPVL1000）将DNA固定在膜上5.探针的标记：   探针可以提前制备好，冻存。根据Roce公司的DIG标记试剂盒进行如下操作：（所用PCR仪ThermoElectronPxE基本型PCR仪）   在25μl反应体系中加入2.5μl10×PCRbuffer（MBI），2.5μl10×PCRDIGDNAlabelingMix（Roce），25pmol上游引物，25pmol下游引物，0.5μlTaq（MBI），50pg模板DNA，同时用未标记D

4、IG的dNTP(MBI)作对照反应。反应条件根据不同的模板稍有变动。反应结束后电泳检测标记效率，标记后的探针应比没有标记的产物分子量大，-20℃冻存备用。6.杂交与检测（NBT/BCIP显色）：(1)将固定好的尼龙膜放于预杂交液中(10ml/100cm2膜)，在杂交炉（Fisher分子杂交箱）中65℃保温4小时；(2)弃去预杂交液，按2.5ml/100cm2膜的量加入杂交液，杂交液中含DIG标记的探针（2μlDIG探针/1ml杂交液），65℃杂交16小时；(3)倒出杂交液，杂交液中含有未杂交的探针，放到-20度备用（4）用2×SSC，0.1%SDS溶液洗膜2×5分钟；

5、 (5)用0.1×SSC，0.1%SDS溶液洗膜2×15分钟； （6）在杂交和严谨洗涤后，将膜置洗涤缓冲液浸润1~5min。 （7）20~30ml封闭液孵育30min；（8）．取anti-DIG-AP（Roce），按1:5000稀释于封闭液中，取20ml该溶液浸泡尼龙膜，室温孵育30分钟； （9）用20~30ml洗涤液洗涤2×15min； （10）15ml检测液中平衡2~5min； （11）显色：现配20ml显色底物（NBT/BCIP）暗处静置显色； （12）50ml灭菌水或TE洗膜5min终止显色，拍照保存，将膜封存于装有TE的塑料袋中，可长期保存。    所涉及溶

6、液的配制：§变性液  0.5mol/L NaOH 1.5mol/LNaCl§中和液  0.5mol/LTris-HCl 3mol/LNaCl§漂洗液WashingBuffer（pH7.5）：0.1mol/L   Maleicacid（马来酸）        0.15mol/L   NaCl        0.3%（v/v）Tween20§马来酸Buffer MaleicacidBuffer（pH7.5）：0.1mol/L     Maleicacid         0.15mol/L    NaCl§检测液DetectionBuffer（pH9.5）：0.1mol/

7、L     Tris-Cl        0.1mol/L     Nacl§TE-buffer（pH8.0）：       10mmol/L    Tris-Cl        1mmol/L     EDTA§20×SSC（pH7.0）：          3.0mol/L     NaCl         0.3mol/L   柠檬酸钠§封闭液：1×workingsolution由10×Blockingsolution（试剂盒提供）用MaleicacidBuffer稀释。§抗体溶液：Anti-Digoxigenin-AP（试剂盒提供），用Blo