western-blot操作流程

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1、Western-Blot操作流程试剂配制（一）母液1.0mol/LTris·HClTris(MW121.14)30.29g蒸馏水200ml溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。PHHCl7.4约17ml7.5约16m7.6约15ml8.0约10ml1.74mg/ml(10mmol/L)PMSFPMSF0.174g异丙醇100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。0.2mol/LNaH2PO4NaH2PO4（MW119.98）12g蒸馏水至500ml溶解后，高压灭菌，室温保存。0.2mol/LNa2HPO4Na2HPO4

2、·12H2O（MW358.14）71.6g蒸馏水至1000ml溶解后，高压灭菌，室温保存。10％SDSSDS10g蒸馏水至100ml50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺0.1g超纯水1.0ml溶解后，4℃保存，保存时间为1周。（可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在EP管中，一次性多装几管，使用时加入超纯水即可）1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）Tris(MW121.14)45.43g超纯水200ml溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。0.5mol/LTris·HCl（pH6.8

3、）Tris(MW121.14)15.14g超纯水200ml溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。40％Acr/Bic（37.5：1）丙稀酰胺（Acr）37.5g甲叉双丙稀酰胺（Bic）1g超纯水至100ml溶解后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。20％Tween20Tween2020ml蒸馏水至100ml混匀后4℃保存。（二）使用液单去污剂裂解液（PMSF）：1mol/LTris·HCl（pH8.0）2.5mlNaCl0.438gTritonX-1000.5ml蒸馏水至50ml混匀后4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/ml（0.87ml

4、裂解液加入1.74mg/mlPMSF50μl）。（一般实际用的比较多的其实是RIPA裂解配方：50mMTris-HClpH7.4、150mMNaCl、1mMPMSF、1mMEDTA、1%Tritonx-100、1%脱氧胆酸钠、0.1%SDS。至于其中每个要加多少量那就自己去算吧，因为本人已经算好的配方表无意间弄丢了）0.01mol/LPBS（pH7.2-7.4）0.2mol/LNaH2PO419ml0.2mol/LNa2HPO481mlNaCl17g蒸馏水至2000ml（如果用TBST进行洗膜的话，其实PBS用得很少，大可不必自己配制，向试剂公司购买20×的PBS浓缩液即可，500ml的浓

5、缩液不到50元，很方便）G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用）考马斯亮蓝G250100mg95％乙醇50ml磷酸100ml蒸馏水至1000ml配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。0.15mol/LNaClNaCl（MW58.44）0.877g蒸馏水至100ml高温灭菌后，室温保存。100mg/ml牛血清白蛋白（BSA）BSA0.1g0.15mol/LNaCl1ml溶解后-20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15mol/LNaCl进行100倍稀释成1mg/ml，-20℃保存。10％分离胶和4％浓缩校10％分离胶（两块胶，10ml）4％浓缩胶（两

6、块胶，5ml）超纯水4.85ml3.16ml40％Acr/Bic（37.5：1）2.5ml0.5ml1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）2.5ml－0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）－1.26ml10％SDS100μl50μl10%AP（过硫酸胺）50μl25μlTEMED5μl5μl加TEMED后，立即混匀即可灌胶。（为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原来的2-3倍，根据实验当时的温度适当调整）还原型5XSDS上样缓冲液0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）2.5ml二硫叔糖醇（DTT，MW154.5）0.39gSDS0.5g溴酚蓝0.

7、025甘油2.5ml混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。电泳液缓冲液Tris（MW121.14）3.03g甘氨酸（MW75.07）18.77gSDS1g蒸馏水至1000ml溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。（电泳液可以回收重复利用，一般将回收的电泳液加入垂直电泳槽的下半部分，上半部分最好使用新鲜的电泳缓冲液）（可以配制成10×电泳液缓冲液进行保存，稀释10倍使用）转移缓冲液甘氨酸（MW75.07）2.9g