western-blot 通用配方

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1、1.WesternBlotting相关溶液及抗体1)转膜缓冲液（runningbuffer）(10×)(1L)Tris30.3g甘氨酸144g不调pH转膜工作液（1×)(1L)（现配现用）(10×)转膜缓冲液（runningbuffer）100ml无水乙醇100ml水800ml2)TBS缓冲液(5×)（1L）Tris-HCl12.15gNaCl146.4g用36-37%浓盐酸调节pH值至约7.4（约5ml浓盐酸，pH试纸检测即可）TBST：TBS+Tween-200.1%（1mlfor1L）3)封闭液T

2、BST缓冲液中加入5%脱脂奶粉或者(3%Gelatine)4）WesternBlotting第一抗体适合于自己蛋白的抗体5）WesternBlotting第二抗体辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG/(羊抗鼠IgG)4.实验步骤（1）SDS-PAGE电泳分离蛋白质：(浓缩胶70V，30-40min；分离胶120V，1h)12%分离胶配方:5ml10ml15ml水1.63.34.930%丙烯酰胺2461.5MTrispH8.81.32.53.810%SDS0.050.10.1510%过硫酸铵（最后加）0.050.

3、10.15TEMED0.0020.0040.0065%浓缩胶1ml2ml3ml4ml水0.681.42.12.730%丙烯酰胺0.170.330.50.671.0MTrispH6.80.130.250.380.510%SDS0.010.020.030.0410%过硫酸铵（最后加）0.010.020.030.04TEMED0.0010.0020.0030.0045×loadingbuffer:4mlddH2O1.76ml1MTris-HClpH6.80.24ml甘油1ml10%（w/v）SDS0.8mlß

4、-巯基乙醇0.2ml（2）将4张滤纸剪成与海棉大小一致的方形（3）配（1×)转膜工作液(10×)转膜缓冲液（runningbuffer）80ml无水乙醇80ml水640ml800ml（4）将胶泡在（1×)转膜工作液中（防止胶干掉，最好不要用水，水泡胶会涨）（5）用尺子量胶大小，裁PDVF膜（不要用手蹭膜，手上有蛋白）（6）PDVF膜先在无水乙醇中泡约1min,然后泡到（1×)转膜工作液中。（PDVF膜为疏水性的，先在乙醇中泡会使其亲水性好）（7）将海绵和滤纸在水中浸湿，然后按照一下顺序(整个操作过程中保

5、证膜不能干)：白板—海绵—两层滤纸--PDVF膜（靠正极）--胶（靠负极）（用小试管排气泡）--两层滤纸—海绵（用小试管排气泡）--夹住—放入胶槽中（白板靠红，黑板靠黑，保证电极方向不要错）--在胶槽中加入转子—倒入（1×)转膜工作液—在胶槽中放入冰袋—80V～100V恒压，60min(该条件可以转移25kD～90kD的蛋白)(8)封闭：在封闭液中室温，摇1h或者4℃静置过夜。（9）漂洗：将PVDF膜在TBST缓冲液中漂洗3次，每次10分钟；(10)一抗：适量的一抗加到TBST+脱脂奶粉(或者是TBST

6、+1%Gelatine)室温摇1h.(11)漂洗：将PVDF膜在TBST缓冲液中漂洗3次，每次10分钟(12)二抗：适量的二抗加到TBST+脱脂奶粉(或者是TBST+1%Gelatine)室温摇1h.（13）漂洗：将PVDF膜在TBST缓冲液中漂洗3次，每次10分钟两种显带方式：曝光法（14）用纸将PVDF膜上的水分吸干，然后将将PVDF膜放在保鲜膜上，将ECL试剂盒中的A液和B液按照1：1的比例混匀（见说明书）后均匀覆盖到PVDF膜上1min,然后用纸将PVDF膜上的溶液吸干，放入X光片的暗盒中。（1

7、5）在暗室中，使用红光灯，将显影液，水，定影液分别倒入三个盘子中，然后取出X光片剪成合适大小，放入含有PVDF膜的暗盒中，曝光一定时间后取出X光片，放入显影液中显影，检测显影的情况，当发现X光片中有条带时，放入水中清洗光片，然后在定影液中定影。然后在黑暗情况下将光片和显影液定影液收好。显影液和定影液应为无色透明，若发现颜色异常、有沉淀或长菌需重配。膜上显色法：（14）增强型HRP-DAB底物显色试剂盒；包括1×HRP缓冲液，试剂A，试剂B和试剂C，三者添加的体积比为1ml1×HRP缓冲液+50μl试剂A

8、+50μl试剂B+50μl试剂C。显色剂体积依照个人的需要配置。将PDVF膜置于显色剂中，暗处静置8-10min，接着用水冲洗以终止反应，然后将纸吸干PDVF膜上残余的水，扫描仪扫图即可。