免疫球蛋白标记技术应用课件

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1、标记抗体的应用荧光抗体标记技术酶标抗体技术荧光抗体染色技术荧光抗体标记技术（fluorescent-labeledantibodytechnique）是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。荧光抗体技术的原理与方法直接法操作简便，特异性高，非特异荧光染色因素少；缺点是敏感度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体。间接法灵敏度高，且在不同抗原的检测中只需用一种荧光抗体。补体法敏感度高，且只需一种抗体。但易出现非特异性染色，加之补体不稳定，每次需采新鲜豚鼠血清，操作复杂。因此较少应用。双标记法用两种荧

2、光素分别标记不同抗体，对同一标本作荧光染色。在有两种相应抗原存在时，可同时见到两种荧光色泽。直接法间接法补体法双标记法基本过程标本制备固定洗涤染色观察（二）固定防止标本脱落除去妨碍抗原和抗体结合的类脂固定的标本片易保存目的：常用抗原物质的固定方法病毒丙酮或无水乙醇室温5-10min或4℃30-60min蛋白质95%-100%乙醇室温3-10min酶、激素丙酮4℃30min抗原物质固定剂固定条件多糖、细菌等甲醇、10%甲醛或室温5-10min或丙酮（微火加热）4℃30-60min（三）水洗固定后以冷的PBS浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。（四）染色直接

3、法间接法+AAbFITC37℃30minPBS洗3次PBS洗3次，蒸馏水冲洗Ag+Ab37℃30minPBS洗3次，蒸馏水冲洗Ag+AbFITC（五）荧光显微镜观察标本上滴加缓冲甘油（9份甘油，1份PBS），用盖玻片封片，荧光显微镜下观察。间接荧光抗体检测细胞培养中的猪瘟病毒（六）标本保存固定标本片后低温保存，随用随染染色片采用优质封固剂，防止荧光激发，封固后低温保存酶标抗体技术免疫酶组化酶联免疫吸附试验（ELISA）（一）免疫酶组化标本片固定0.3%-3%H2O2室温15-30min缓冲液冲洗酶标抗体37℃30-45min缓冲液冲洗DAB室温染色缓冲液冲洗干燥

4、脱水二甲苯透明封片观察直接法间接法对照组设置已知阳性标本已知阴性标本抗体抑制试验DAB-H2O2底物染色对照检查内源性酶被抑制的情况注意事项标本必须新鲜，否则非特异性反应严重消除内源性酶消除背景颜色酶标抗体浓度的确定免疫组化常见问题染色过强非特异性背景染色染色弱染色阴性1染色过强酶标抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长孵育温度过高，孵育温度超过37℃DAB显色时间过长或DAB浓度过高2非特异性背景染色操作过程中冲洗不充分组织中含过氧化物酶未阻断组织中含内源性生物素血清蛋白封闭不充分3染色弱酶标抗体浓度过低，孵育时间过短试剂超过有效使用期操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干

5、，致使试剂稀释室温太低，低于15℃4染色阴性操作步骤错误组织中无抗原一抗与二抗种属连接错误酶联免疫吸附试验（ELISA）原理：ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。加入酶反应的底物，由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果。种类间接法夹心法竞争法Ag+Ab+AAbE+底物（1）间接ELISA（待检）Ab+Ag+AbE+底物（2）夹心ELISA（待检）（3）竞争ELISAEEEEEEEEE显色反应弱显色反应强EEEEE固

6、相抗体酶标抗原待测抗原底物固相抗体酶标抗原待测抗原底物一、临床标本的收集和保存要注意避免出现严重溶血样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2～8℃下保存一周，如为有菌操作，则冰冻保存。样本的长时间保存，应在-70℃以下冰冻保存的血清标本须注意避免反复冻融标本在保存中如出现混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测二、ELISA试验条件的选择免疫吸附条件酶标记的抗体（或抗原）酶的底物洗涤液酶反应终止液阳性对照品和阴性对照品(一）免疫吸附条件固相载体包被的方式包被用抗原包被用抗体包被的条件封闭1.固相载体的选择不参与化学反应，抗

7、体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近最常用的是聚苯乙烯微量滴定板吸附性能检查方法人IgG包被加入酶标抗人IgG抗体加底物显色终止酶反应，测每孔吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度0.8左右。计算全部读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均数之差，应小于10%。对比测定阳性血清和阴性血清，观察是否存在明显差异，若二者相差10倍以上为合格2.包被的方式抗体的包被一般采用直接吸附法蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时，可采用间接捕获包被法,抗体预包

8、被（也适用含杂质多的或含