免疫标记技术应用.ppt

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1、标记技术的应用一、目的和意义二、标记技术的种类酶学标记荧光标记同位素标记基因标记BrdU标记荧光染料标记免疫磁珠MTT比色法酶学标记的种类、原理与应用免疫组织化学实验酶联免疫吸附实验（ELISA）酶联免疫斑点实验（ELISPOT）原位杂交酶学组织化学免疫组化组织片的免疫组化染色细胞培养片组化免疫组织化学分类细胞培养片:组织切片：石蜡切片冷冻切片注意事项：1、抗体2、操作过程细胞组织切片注意事项组织切片：石蜡切片冷冻切片酶联免疫吸附实验（ELISA）ELISA应用及注意事项ELISA应用1、检测抗体2、检测抗原注意事项1、保持反应板地清洁2、不要在反应板中稀释待测样品3、检测样品中不要有气泡4

2、、机器所取数据时应多读取几次原位杂交酶学组织化学荧光标记直接法间接法肌肉组织直接荧光检测AchR染色流式细胞仪检测实验结果间接荧光染色双重/多重荧光染色Western-Blot实验同位素标记细胞增殖实验同位素标记寡核苷酸探针杂交细胞增殖实验原理：3H-TdR即（甲基-3H）胸腺嘧啶核苷酸（[3H-methyl]thymidine）是DNA合成的前体。其加入培养液中后被细胞摄取，作为DNA合成的原料。细胞合成的DNA越多，则所掺入的3H-TdR量也越多。检测所掺入的3H-TdR，就可反映细胞增殖的程度。同位素标记寡核苷酸探针杂交细胞和组织的原位杂交原位杂交和组化双染和多染基因标记GFP（Gre

3、enFluorescentProtein绿色荧光蛋白）LacZ（β-galactosyltransferaseβ-半乳糖苷酶）CAT(Chloramphenicolacetyltransferase氯霉素乙酰转移酶）GFP的性质1962年在水母中发现，1992由Prasher克隆有238个氨基酸组成，分子量为27KD野生型GFP被紫外蓝光激发后，能发出绿色荧光不需要底物或辅助因子，可对活体检测、体积小、表达无种属限制、荧光表达稳定、有多种突变体、检测方便、无放大作用GFP基因转染方式磷酸钙法DEAE-葡聚糖转染法脂质体介导的转染电穿孔转染法基因枪粒子轰击法受体介导的基因导入法GFP标记的

4、神经元GFP应用细胞发育分化研究标记基因筛选阳性胚胎荧光动物模型细胞移植示踪LacZ（β-半乳糖苷酶）原理LacZ（β-半乳糖苷酶）可将X-gal（5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）转变为不溶性的深蓝色沉淀PITX2-LACZStainingofmouseembryoday11溴脱氧尿嘧啶核苷(Bromodeoxyuridine,BrdU)溴脱氧尿嘧啶核苷(Bromodeoxyuridine,BrdU)BrdU是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物，通过竞争参入S期细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)特点简单、快速、安全、检测的敏感性好在免疫细胞化学技术中，可

5、产生一种对比度高的标记，适合于大块组织的快速检查，尤适于定量研究即可适于活体标记，亦可以用于细胞或组织细胞增殖、分化的标记对活体动物无任何副作用BrdU标记的组化和荧光照片荧光染料标记核标记膜标记核标记4，6-联脒-2-苯基吲哚（4‘,6-diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride，DAPI)DAPI荧光染料是由Dann等人于1971年合成的，共化学名称为的中文名称4，6-联脒-2-苯基吲哚，分子量为350．它是二价阳离于的荧光染料，一种黄色晶体易溶于水，最大溶解度为2．5％．它具有专一性强、灵敏度高、稳定性好等特点。DAPI不足：1、DAPI除与DNA

6、双链结合外，还可与细胞浆中的微管蛋白结合，故胞浆也着蓝色。2、DAPI标记细胞的很大不足就是当标记细胞死亡后，就可以释放出DAPI，将周围未标记的细胞标记，产生假阳性，这是我们用这类荧光染料标记细胞时必须考虑的问题。DAPI标记大鼠骨髓基质干细胞DAPI标记神经细胞膜标记PKH26/PKH67PKH荧光细胞标记试剂细胞膜标记技术，在细胞膜的脂质双分子层中稳定结合红色荧光染料－PKH26/绿色荧光染料－PKH67，产生稳定、清晰、精确和可重复的荧光标记细胞，可广泛用于动物、植物细胞和其它含颗粒胞膜的标记。Advantage：1．标记的细胞种类广，无明显细胞毒性；2．既满足染料最大溶解性和染色效

7、率，又保存细胞活力;3．适用于体外细胞增殖试验；4．适合体内、体外细胞迁移研究ABC5week6week7week免疫磁珠技术MTT（噻唑蓝）比色法原理：活细胞线粒体中的琥伯酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲臜并沉积在细胞中，死亡细胞无此功能。二甲基亚枫（DMSO)能溶解细胞中的甲臜。490nm吸收峰。应用：生物活性因子的活性检测抗肿瘤药物筛选细胞毒性检测肿瘤放射敏感性测定特点：敏感度高