《免疫标记技术》ppt课件

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1、第十一章免疫标记技术第一节免疫标记技术简介将某种可微量或超微量测定的物质（如放射性核素、荧光素、酶、化学发光剂等）标记于抗原（抗体）上制成标记物，加入到抗原抗体的反应体系中与相应的抗体（抗原）反应，以检测标记物的有无及含量的多少，间接反映被测物的存在。称做免疫标记技术（immunolabellingtechnique）。免疫标记技术概念优点:特异、敏感、快速；能定性和定量甚至定位，且易于观察。免疫标记技术的分类免疫荧光标记技术免疫酶标记技术放射免疫测定法金免疫技术、化学发光免疫技术、免疫印迹技术、流式细胞术一、免疫荧光标记技

2、术(immunofluorescence,IF)用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中抗原反应，荧光显微镜下观察，抗原-抗体复合物散发荧光，借此对抗原进行定性或定位。免疫荧光法可用于检测多种病原体的抗原、抗体，或鉴定免疫细胞膜抗原。二、免疫酶标记技术(enzymeimmunoassay,EIA)将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，借助酶作用于底物的显色反应判定结果。应用酶标测定仪测定光密度（OD）值可反映抗原含量，灵敏度达ng/ml甚至pg/ml水平。三、放射免疫测定法(radioimmunoassay

3、,RIA)用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。该法兼有放射性核素的高灵敏度和抗原-抗体反应的特异性，检测灵敏度达pg水平。常用于标记的放射性核素为125I和131I，分为液相和固相两种方法。常用于测定微量物质，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素；吗啡、地高辛、IgE等。一、荧光基础知识简介（一）荧光的产生一些化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。第二节免疫荧光标记技术荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。荧光种类致

4、荧光：光激发产生化学荧光X线荧光阴极射线荧光可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。荧光发射的特点是：（二）荧光效率荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。荧光效率＝发射荧光的光量子数/吸收光的光量子数（三）荧光的猝灭荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射荧光物质的保存应注意避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。（

5、四）常用的免疫标记荧光物质1、异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC）黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。最大吸收光波长为490nm～495nm，最大发射光波长520nm～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。2、四乙基罗丹明（rhodamine,RIB200）橘红色粉末，易溶于酒精。性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595nm～60

6、0nm，呈橘红色荧光。3、四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC）紫红色结晶粉末，溶于水和酒精。最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色，其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。二、荧光免疫标记技术原理和方法（一）原理荧光免疫技术是用化学方法使荧光素标记的抗体（或抗原）与组织或细胞中的相应抗原（或抗体）结合，进行定性定位检查抗原或抗体的方法。（二）方法1、直接荧光法把荧光

7、抗体加到待检的细胞悬液、细胞涂片或组织切片上进行染色，经抗原抗体反应后，洗去未结合的荧光抗体。将待检标本在荧光显微镜下观察，有荧光的部位即有相应抗原存在。可用于病毒感染细胞、带某种特异抗原的细胞（如T细胞和B细胞）或病原菌的检查，也可用于组织中沉着的免疫复合物的检查。抗原标记抗体光原荧光直接法原理示意图缺点：检查每种抗原均需制备相应标记的抗体炭疽杆菌24h培养物直接荧光抗体检测间接法原理示意图抗原抗体标记抗体光原荧光(一)间接法将抗体(一抗)与标本中的抗原结合,再用FITC标记的二抗染色。2、间接荧光法将组织或细胞上的抗原直

8、接与相应抗体（不标记荧光）结合，此为第一抗体，再把能与第一抗体特异结合的荧光标记的抗免疫球蛋白抗体加入，此为荧光标记的第二抗体，在荧光显微镜下观察荧光。间接法原理示意图抗原抗体标记抗体光原荧光优点：敏感，一种标记抗体可以检测多种抗原缺点：操作繁琐3、免疫荧光细胞化学先将已知的抗原或抗体标记