金免疫标记技术课件.ppt

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1、任务九金免疫标记技术知识目标技能目标素质目标1.掌握金免疫标记技术原理和分类2.了解标记物的制备3.了解金免疫检测的临床应用1.会金免疫标记物的制备操作2.会熟练操作金免疫检测过程树立严肃认真、实事求是、高度负责的科学态度，具有良好的职业素质和崇高的职业道德。任务目标任务对象肺炎支原体抗体检测任务过程复习提问案例导入讲解与示教学生操作讨论分析评价、考核课后思考题教学环节2′30′2′10′40′5′1′患儿，女，11岁，间断发热1周，伴咳嗽3天。体温最高39。1度，病程第2天查血常规正常，诊断“呼吸道感染”并静滴“阿奇霉素”3天，无明显改变，即而出现咳嗽，为阵发性刺激性

2、咳嗽，少痰，胸片提示：双肺纹理增粗，右上肺片影。复查血常规仍正常。患儿肺部感染系哪种病原体所致？如何快速诊断？案例导入斑点金免疫层析法演示肺炎支原体诊断试剂盒讲解与示教二用采血针采指尖血一洗净双手四立即加1-2滴缓冲液三将1滴指尖血滴入加样孔操作步骤5：15分钟读取结果？？结果？？结果老师纠正点评学生操作一位学生操作演示学生分组再操作讨论分析提出问题为什么在小小的试纸条上出现两条红线就是阳性结果，如此简单、方便的方法可靠吗？有假阳性或假阴性的可能吗？如何检测出来的，原理是什么？胶体金标记技术(Immunogoldlabelingtechnique)是以胶体金作为示踪标记

3、物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。讨论分析胶体金标记技术讨论分析（一）金免疫检测原理胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广

4、泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。讨论分析Geobegan等将胶体金标记抗体用于普通光镜下检测B淋巴细脑表面膜免疫球蛋白，建立了光镜水平的免疫金染色。Faulk和Taylor首创胶体金标记免疫电镜技术胶体金标记技术进一步发展应用于免疫转印、流式细胞术、液相免疫测定、固相斑点金／银染色及斑点金免疫渗滤测定法等多种标记免疫检测方法1971年1978年近年来讨论分析讨论分析枸橼酸三钠还原法鞣酸—枸橼酸钠还原法根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。常用来制备胶体金颗粒的方法胶体金的制备1．枸橼酸三钠还原法（1）10nm胶体金粒的制备：取0.01％HAu

5、Cl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4℃，溶液呈红色。（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min～30min，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/LK2CO30.5ml，混匀即可。（3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15

6、nm、18～20nm、30nm和50nm讨论分析2．鞣酸—枸橼酸钠还原法A液：1％HAuCl4水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。B液：1％枸橼酸三钠4ml，1％鞣酸0.7ml，0.1Mol/LK2CO3液0.2ml，混合，加入双馏水至20ml。将A液、B液分别加热至60℃，在电磁搅拌下迅速将B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为5nm。如需要制备其它直径的金颗粒，则按表15-1所列的数字调整鞣酸及K2CO3的用量讨论分析（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水

7、冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。（2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜（0.45µm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。制备高质量胶体金的注意事项讨论分析（3）配制胶体金溶液的pH以中性（pH7.2）较好。（4）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好是进口的。（5）氯金酸配成1％水溶液在4℃可保持数月稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，最好将整个小包装一次性溶解。制备高质量胶体金的注意事