免疫标记技术,1节酶免疫技术ppt课件.ppt

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1、免疫学检验第十六章酶免疫技术1.酶联免疫吸附试验的原理、方法类型、应用及注意事项。2.酶免疫分析技术的分类。3.常用的酶及酶的底物。4.其他酶免疫技术的基本原理及应用。本章要点目　录酶标志物的制备1酶联免疫吸附试验2其他酶免疫技术3前言酶免疫分析技术是以酶标记抗原或抗体为主要试剂，检测样本中相应的抗体或抗原。将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物的放大作用和高敏感性相结合的一种免疫检测技术。酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相非均相固相酶免疫测定液相酶免疫测定第一节酶标志物的制备一、常用的酶和底物标记酶的条件：1.活性高，纯度高2.作用专一性强3.

2、性质稳定，易与抗原或抗体偶联4.测定方法简便易行、敏感、精确5.酶和底物对人体无害且价廉易得1.辣根过氧化物酶（HRP）糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关辅基是酶的活性中心RZ值越大纯度越高RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要ELISA中应用最为广泛的标记用酶常用酶HRP的底物DH2+H2O2→→→D+2H2OHRP供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种。H2O2为受氢体，不稳定，需在用前临时配置。OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为

3、黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。HRP的常见底物2.碱性磷酸酶是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌中提取。ALP底物对-硝基苯磷酸酯（pNPP）经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。二、制备酶标记抗体(抗原）的方法制备酶标记物的方法应符合简单、产量高，避免酶、抗体（抗原）、酶标记物各自形成聚合物，标记反应不影响酶的活性和抗原抗体的免疫反应性等原则。主要方法：戊二醛交联法改良过碘酸钠法三、酶标记物的纯化与鉴定纯化的方法较多，分离大分子混合物的方法均可应用。常用的是凝胶层析法和硫酸铵盐析法

4、，硫酸铵盐析法操作简便。酶标记物的鉴定主要有：1、酶活性和抗体（抗原）免疫活性的鉴定2、酶标记率的测定四、固相载体（一）固相载体的要求①结合抗体或抗原的容量大；②与抗原或抗体结合稳定且不易脱落；③不影响所固定的抗体或抗原的活性；④固化方法应简便、快速。（二）固相载体的种类1．塑料制品由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形状主要有微量反应板、小试管和小珠三种。2．微粒微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒。3.膜载体是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸纤维素膜（NC）、玻璃纤维素膜等。第二节酶联免疫吸附试验一、ELISA的检测原理将已知抗原或抗体吸附在固相载

5、体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤的方法将固相上的抗原抗体复合物与液相中的游离成分分开。加入酶的底物后，通过酶对底物催化的显色反应程度，对标本中抗原或抗体进行定性或定量。二、ELISA的方法类型（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，适用于检测含有至少两个抗原决定簇的较大分子抗原的测定。E固相抗体标本（含抗原）酶标抗体EE底物如果血清标本中含有类风湿因子（RF），则可出现假阳性反应。因为类风湿因子是一种抗变性IgG的自身抗体，它可同时与固相抗体和酶标抗体的Fc段发生结合，导致假阳性的出现。（二）双位点一步法测定抗原时，

6、如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。EEE底物固相抗体标本（含抗原）酶标抗体如果待检标本中抗原浓度过高，容易形成“钩状效应（hookeffect）”。钩状效应严重时，可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当稀释后重新测定。（三）间接法间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体（亦称为酶标二抗）来检测已与固相结合的待测抗体。固相抗原标本（含抗体）酶标二抗底物EEE此法由于受血清中高浓度非特异性IgG的干扰，通常要将待测标本进行一定稀释后

7、才能测定。（四）竞争法竞争法既可用于检测抗原，也可用于检测抗体。待测抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与待测抗原的量呈反比，待测抗原越多，其结合特异性抗体越多，而酶标抗原与特异性抗体结合就减少，底物显色反应浅；显色越深，待测抗原量则越少。竞争法测抗原酶标抗原EEEE固相抗体标本（含抗原）底物E竞争法主要用于检测小分子抗原，因小分子抗原只有一个抗原决定簇。竞争法检测抗体HBcAb和HBeAb的测定均采用竞争法，但其测定具体模式有区别。1.竞争法检测HBcAb：先将HBcAg包被在固相载体上，形成固相抗原，之后加入待测样

8、本和酶标的特异抗体，待测样本的抗体将与酶标抗体竞争与固相载体上的特异抗原结合，温育后洗涤，加入酶底物显色，显色的强弱与待测抗体的含量成反比。固相抗原标本（含抗体）底