三角梅issr反应体系的建立和优化

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1、三角梅ISSR反应体系的建立和优化［摘要］对影响三角梅ISSR-PCR扩增反应的各个参数进行优化，建立适合三角梅的ISSR反应体系:PCR反应体积为20µL,其中10Xbuffer(含Mg2+)2.0µL?dNTP250µmol/L,Taq酶1.0U,引物0.3µmol/L，模板DNA20ng。扩增程序为:94°C预变性5min;94°C变性lmin,51.6'C退火lmin,72°C延伸2min、34个循环;最后72°C延伸7min。该反应体系标记点位清晰、稳定、重复性好，适宜三角梅ISSR分析,为应用ISSR技术鉴定三角梅种质资源

2、、分子标记辅助选择育种及其遗传多样性研宄奠定了基础。［关键词］三角梅ISSR体系建立优化三角梅(BougainvilleaspectabilisWilld)又名九重葛、毛宝巾、勒杜鹃，在我国己有100多年的栽培历史，品种丰富。我国部分研宄者在同工酶水平上对三角梅品种进行亲缘关系分析但存在难以解释之处［U至今仍有分类标准不统一、分类手段有一定的局限性，所得分类结果不一致以及同名异物、同物异名等问题，从而给生产、园林应用、交流等方面带来诸多困难。而三角梅有关分子标记方面的研宄仍是空白，因此利用分子标记技术进行三角梅的分类、品种鉴定等研宄显得尤为重要。ISSR(简单重复序列间隔区Jnte

3、r-SimpleSequenceRepeat)是由Zietkiewicz等于1994年创建的一种简单序列重复区间扩增多态性的分子标记［2］。ISSR具有操作简单，标记重复性好，稳定程度高，多态性丰富，DNA用量少，成本低等优点。ISSR标记已广泛地用于遗传多样性、品种鉴定、系统发育、基因定位、分子标记育种等方面［3］。试验对影响三角梅ISSR-PCR扩增反应的各个参数进行优化，建立适合三角梅的ISSR-PCR反应体系，为应用ISSR分子标记技术进行三角梅种质资源研究、分子育种等创造条件。1材料与方法1.1材料试验材料为三角梅“亮叶紫花”品种嫩叶。取材自厦门植物园。1.2试剂和仪器I

4、SSR引物序列源自加拿大的UniversityofBritishColumbia,购自上海生物工程技术服务有限公司。Taq酶等试剂购自大连宝生物(TAKARA)有限公司。梯度PCR仪Tgradient为Biometra公司产品。1.3方法1.3.1三角梅基因组DNA的提取采用改进的CTAB法［4］提取基因组DNAoDNA经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，用TU-1810紫外分光光度计测定OD260/OD280的吸光值，确定DNA浓度和质量。DNA在-20°C保存备用。1.3.2ISSR-PCR反应体系参数的优化参照其它物种ISSR反应的条件［5〜7］以及预备试验的结果，初步设定各成分的

5、用量:ISSR-PCR反应体积为20µL,10Xbuffer(含Mg2+)2.0µL,模板DNA20ng，Taq酶1.0U,引物0.3µmol/L,dNTP200µmol/LoPCR扩增反应程序是:94°C预变性5min;94°C变性lmin、52°C退火lmin，72°C延伸2min,38个循环;72°C延伸7min。PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳分析上,100V稳压电泳2.0h,EB染色，凝胶成像系统观察、拍照。经过初步的引物筛选、选用引物UBC814(CTCTCTCTCTCTCTCTA)进行PCR反应体系的建立和优化。对

6、影响ISSR-PCR扩增的主要参数设置了不同的梯度:采用梯度PCR模式、以TM值52.18为中心，生成了48.1°C、49.2°C>50.4'C、51.6'C、52.8°C>54°C、55.2'C7个退火温度梯度;设计10、20、30、50、75、100、150ng7个模板DNA用量梯度;0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5U7个Taq酶用量梯度;0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7µmol/L7个引物浓度梯度;100、150、200、250、300、350、400µmol/L7个dNTP浓度梯度以及31、34、37、40

7、、43、46、497个循环数。2结果与分析2.1DNA检狈I)用1%琼脂糖凝胶电泳,检测其完整性，由图1的结果可以看到1条整齐的条带，无弥散的荧光出现，加I样孔清晰,表明所提取的DNA样品较纯,基本没有多糖等杂质，无降解和RNA污染。DNA样品在紫外分光光度计测定OD260、OD280ZOD260/OD280比值在1.65~1.85之间，符合PCR的要求。M:15000bpDNAladder;l〜5为三角梅样品图1三角梅DNA电泳图2.2退火温度对扩增结果的影响退火温