药学毕业论文柴胡issr-pcr反应体系的建立与优化

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1、XX大学毕业论文柴胡ISSR-PCR反应体系的建立与优化2014年6月25日柴胡ISSR-PCR反应体系的建立与优化作者：隋春魏建和陈士林杨新全杨成民【摘要】目的建立适于柴胡ISSR分析的PCR反应体系；筛选适宜引物,并确定最佳退火温度。方法CTAB法提取叶片DNA,通过单因子实验分别找出合适的ISSR・PCR反应条件，利用梯度PCR确定引物最佳退火温度。结果适于柴胡ISSR分析的PCR反应体系为25(11总体积中含冇lxTaq酶缓冲液，2.0mmol/LMgC12,齐0.15mmol/L的dNTPs,0.3pmo

2、l/L引物，1.5UTaq酶(上海生工)，20ng模板DNA,2%去离子甲酰胺。在100条引物中筛选出30条扩增条带清晰且条带数口较多的引物，最佳退火温度为49.9〜63.6°C(因引物不同而异)。结论建立了柴胡ISSR・PCR反应体系，筛选出30条引物并确定了最佳退火温度，为应用ISSR技术鉴定柴胡种质资源、分子标记辅助选择冇种及英遗传多样性研究奠定了基础。【关键词】柴胡基因组DNA提取ISSRPCRAbstract：ObjectiveToestablishandoptimizetheISSR・PCRreacti

3、onsystemforBupleurumchinenseDC.;toscreenthesuitableprimersanddeterminetheiroptimalannealingtemperatures.MethodsGenomicDNAwasextractedbyCTABmethodfromBupleurumchinenseDC.plantleaves.Themaininfluencingelementsindifferentlevelsweretestedbysinglefactorexperiment.T

4、hegradientPCRwasusedtodeterminetheoptimalannealingtemperaturesofeachselectedprime匸ResultsTheoptimalreactionsystemforISSRanalysiscontainslxTaqDNApolymerasereactionbuffer,20ngtemplateDNA,1.5UTaqDNApolymerase,2.0mmol/LMgC12,0.15mmol/LeachofdNTPs,0.3

5、imol/Lprimer,

6、2%formamidedeionizedin25(iltotalreactionvolume.30primerswhichshowedclearerandmorebandsfrom100primerswereselectedandtheoptimalannealingtemperatureswere49.9~63.6°C(changedamongdifferentprimers).ConclusionThestableandreproducibleoptimalISSR-PCRreactionsystemandsu

7、itableannealingtemperaturesof30selectedprimersfrom100areestablishedforBupleurumchinenseDC.whichhadlaidthegoodfoundationforISSRanalysisonstudiesofgermplasmresourcesidentification,molecularmarkerassistedbreedingandgeneticdiversity.Keywords:BupleurumchinenseDC.;G

8、enomicDNAextraction;ISSR-PCR柴胡为伞形科(Umbelliferae)柴胡属BupleurumL.植物。属内植物种类很多,全世界约冇150种，是伞形科屮的一个大屈。据屮国植物志记载我国共冇柴胡屈植物36种，17变种，7变型［1］。包括柴胡属在内的伞形科植物的分类鉴定一直是植物分类研究的热点之一。分子生物学技术的应用能够为植物分类与进化研究提供更多分子方面的证据。口前已有利用脂嗨同工酶谱带［2］、ITS序列分析［3,4］及RAPD方法［5］针对柴胡属内不同种进行了鉴定研究。另外，柴胡的野生资

9、源E1H渐减少，各地正积极推进北柴胡的家种生产，栽培新品种的选疗势在必行。分了标记技术是现代分了育种过程必不可少的技术z—,可以用于育种材料的选择，也口J以在杂种后代早期选择鉴定中加以利用，以减少育种盲打性,加速育种进程。ISSR(Inter-SimpleSequenceRepeat)分子标记技术又称为简单序列重复区间扩增，由加拿大蒙特利尔大学的Zietki