番茄issr-pcr反应体系优化与验证

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1、番茄ISSR-PCR反应体系的优化与验证-农学论文番茄ISSR-PCR反应体系的优化与验证李永平1,2,3，康建坂1,2,3，林珲1,2,3（1福建省农业科学院蔬菜研究中心，福州350013；2福建省农业科学院作物研究所，福州350013，3福建省蔬菜工程技术研究中心，福州350013）摘要：研究番茄ISSR-PCR反应体系中主要因子TaqDNA聚合酶、dNTP、引物和DNA模板的浓度及各引物的退火温度对扩增结果的影响，建立番茄ISSR-PCR反应的优化体系，为ISSR技术在番茄分子辅助育种应用提供

2、参考。实验确定番茄ISSR-PCR20μL反应体系为：2.0μL10×PCR缓冲液，0.3μmol/L引物，50ng模板DNA，0.5mmol/LdNTP，2UTaqDNA聚合酶，各引物最佳退火温度有所不同。关键词：番茄；亲缘关系；ISSR；优化中图分类号：S795.9文献标志码：A论文编号：cjas15080012基金项目：福建省自然科学基金项目“利用SSR和SRAP标记构建辣椒遗传图谱”(2014J01115)；福建省农业科技重大专项“茄果类蔬菜新品种选育与种业产业化研究”(2013NZ0002

3、-3)。第一作者简介：李永平，女，1974年出生，福建顺昌人，硕士，研究方向：蔬菜育种。通信地址：350003福建省福州市五四路247号福建省农科院高新大楼1711，E-mail：[emailprotected]。通讯作者：康建坂，男，1976年出生，福建永春人，副研究员，硕士，研究方向：蔬菜育种。通信地址：350003福建省福州市五四路24712/12号福建省农科院高新大楼1711，E-mail：[emailprotected]。收稿日期：2015-08-20，修回日期：2015-11-16。0引

4、言在生物技术研究领域中，分子技术一直是研究的热点。ISSR结合了SSR和RAPD的优点，克服了RFLP与RAPD的不足，简单方便，可以检测到更高的种间遗传差异，稳定性也较高[1-3]。因此，ISSR标记技术被广泛应用于遗传多样性[4-6]、遗传图谱构建[7-8]、种子纯度鉴定[9-10]、植物分类学[11]等研究中，但ISSR-PCR的扩增效果受物种、反应体系及扩增程序等的影响，不同作物最佳反应体系差异较大。番茄(Lycopersiconesculentum)因果实营养丰富，具特殊风味，是在全世界栽

5、培最普遍的果菜之一，中国各地也普遍种植。1994年，加拿大蒙特利大学Zietkiewicze等[12]利用了RAPD技术优点和基因组中丰富的SSR序列信息，提出了一种新的分子标记技术（inter-simplesequencerepeat，简单重复间序列，ISSR）。它可用少量DNA在没有分子生物学研究基础的情况下构建基因组指纹图谱[13-15]，由于可同时检测多个SSR座位，重复性好，被广泛应用于遗传多样性[16-19]、种质资源鉴定[12]、分子辅助育种[20]、基因定位[21]、种子纯度鉴定[2

6、2-23]、植物分类学[24]等方面。ISSR标记能补充遗传图谱中一些RFLP标记稀少、间断或空白区，它在QTL定位中也逐渐得到较多的应用[1-2]。ISSR是基于PCR的分子标记技术，不同植物材料、实验材料及不同扩增条件都将影响其扩增效果[3-4]。12/12笔者对影响番茄ISSR-PCR反应体系主要因素进行优化实验，旨在建立番茄ISSR-PCR最佳反应体系，为ISSR技术在番茄分子辅助育种应用提供参考。1材料与方法1.1供试材料研究所用材料由福建省农业科学院蔬菜中心提供，体系建立材料为番茄高代自

7、交系T9，验证材料为38个番茄高代自交系。主要试剂为10×PCRbuffer（含Mg+，Tiangen公司产），TaqDNA聚合酶（Tiangen公司），dNTP（上海生工生物工程公司产），Mark2000（上海生工生物工程公司产）。ISSR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。1.2实验方法1.2.1基因组DNA的提取与检测各番茄品种选取3株健壮、无病虫害、具有本品种特征特性的植株混合取样，每株摘取1~2片幼小、舒展的心叶，用改进的微量CTAB法[5-8]提取DNA。加入1μLRNase，37℃水浴

8、30min，纯化DNA。检测各样品的纯度并计算其浓度，将各样品浓度稀释至50ng/μL备用。用8g/L琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的完整性。1.2.2ISSR-PCR扩增及产物的电泳分析扩增反应在GeneAmpPCRSystem9600（Applera公司）上进行。实验采用20μL体系：2.0mmol/LMgCl2，2.0μL10×PCR缓冲液，50ng模板DNA，0.3μmol/L引物，0.50mmol/LdNTP，2.0UTaqDNA聚合酶，加入超纯水至20μL。P