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《东方蜜蜂issr反应体系的建立及优化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、东方蜜蜂ISSR反应体系的建立及优化2009年第9期蜜蜂杂志(月刊)JOURNALOFBEE(Monthly)东方蜜蜂ISSR反应体系的建立及优化谭宏伟,张夏,董霞,李听安(云南农业大学东方蜜蜂研究所,云南昆明650201)摘要:以东方蜜蜂JDcerana)为材料,对影响IS-SR-PCR扩增结果的因素如模版DNA,Mg,dNTPs,TaqDNA聚合酶,引物的浓度及退火温度进行了研究.确立了适合东方蜜蜂ISSR扩增的反应体系:25L反应体系中最适含量为:10xPCRbuffer2.5L,2.5mmol/LMgC
2、l2,0.2mmol/LdNTPs,lUTaqDNA聚合酶,0.4pmol/mL引物,2O～40ng模板DNA.PCR反应程序为:94cc预变性5min,94oc变性1min,52.3oc(引物UBC811优化后的退火温度,退火温度随引物不同而定)退火30s,72cc延伸30s,35个循环,72oc再延伸5min,在4cc保存.优化体系的建立为进一步利用ISSR分子标记技术进行东方蜜蜂遗传多样性研究奠定了基础.关键词:东方蜜蜂;简单序列重复间区(ISSR);PCR反应体系;优化中图分类号:$893.2文献标识码
3、:A文章编号:1003-9139(2009)09—0012-04Establishmentand0ptimizationofISSRReactionSystemforApisceranaTANHong—wei,ZHANGXia,DONGXia,LITing—an(EasternBeeResearchInstitute,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China)Abstract:EasternbeeDcerana)wassubjectedt0IS-SR——P
4、CRtoinvestigatethegeneticdiversityandthespe——cificmolecularmarkersfinkemslinkedtospecificcharac-ters.Bystudyingthemainparameters.theoptimalIS—SR-PCRreactionconditionswereestablished.Resultsshowthatinareactionsystemwithatotalvolumeof25'LL,10xPCRbuffer2.5L.2.5
5、mmol/LHgO.2mmol/LdNTPs.1.OunitofTaqDNApolymerase,0.4pmol/l~Lprimerand20～40ngtemplateDNAshouldbecontained.TheproceduresforPCRamplificationwere:initialdenaturationat94oCfor5min,35cyclesofdenaturationat94ocforlmin.anneal-ingat52.3~Cfor30sandextensionat72ocfor30
6、s,andafinal5minextensionat72.c.thenkeptthetemperatureat25cc.Keywords:Apisceranc;ISSR:PCRreactionsystem;Op—t1m1zation东方蜜蜂是我国故有的地方蜂种资源,东方蜜蜂在西方蜜蜂未被引进我国之前,是惟一可以进行人工饲养而获得产品的蜜蜂,现在也是我国山区重要的饲养蜂种,对这些地区的植物授粉和植被体系的形成起到重要作用,对我国山区农民的生活和经济做出了极大贡献,是我国的宝贵物种[】J.ISSR是Zietkiew
7、icz等翻于1994年创建的基于PCR的一种新微卫星类分子标记,ISSR标记为显性标记,符合孟德尔遗传规律,遗传多态性高,重复性好,实验操作简单,快速,结合了RAPD标记技术和SSR标记技术的优点.因此,ISSR近年来已广泛用于动植物种质资源鉴定及遗传多样性等方面的研究.本研究旨在通过研究ISSR—PCR反应体系中各种因素对其扩增结果的影响,获得东方蜜蜂ISSR反应的最佳体系,为东方蜜蜂种质资源的遗传多样性和分子标记辅助育种等方面的研究提供可靠的技术支持.1材料和方法1.1材料及试剂东方蜜蜂样品来自于云南农业大
8、学东方蜜蜂研究所内保存样品(75%乙醇保存),PCR试剂为大连宝生物工程公司产品,引物由上海生物工程有限公司合成.1.2基因组DNA提取采用酚～氯仿抽提法对DNA进行提取,0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量,DNA浓度和DNA纯度的检测在EppendoffBioPhotometer(德国,EPPENDORF公司)核酸定量仪上进行,并将浓度稀释至40nWL,一20℃保存.1.3JS
