珍稀濒危植物宝华玉兰issr―pcr反应体系建立及优化

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1、珍稀濒危植物宝华玉兰ISSR―PCR反应体系建立及优化　　摘要：为建立和优化宝华玉兰（MagnoliazeniiCheng）ISSR-PCR反应体系，采用正交试验和单因子试验方法对影响PCR扩增体系中的Mg2+、dNTPs、DNA模板、引物和Taq聚合酶一定浓度的用量5个因子进行分析比较。结果显示，宝华玉兰ISSR-PCR25μL反应体系中的5个因子最佳水平分别为DNA模板（20ng/μL）3.5μL，引物（10μmol/L）1.25μL，Taq聚合酶（5U/μL）0.2μL，Mg2+（25mmol/L）2.0μL

2、，dNTPs（2.5mmol/L）0.8μL。宝华玉兰ISSR-PCR反应的最优体系建立，为进一步利用ISSR对其进行分子标记辅助育种、分子身份证构建和遗传多样性分析等后续研究奠定了基础。　　关键词：宝华玉兰（MagnoliazeniiCheng）；ISSR-PCR反应体系；种质资源保护　　中图分类号：Q949.747.1+2文献标识码：A文章编号：0439-8114（2016）16-4206-04　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.034　　宝华玉兰（Magno

3、liazenii4Cheng）是木兰科（Magnoliaceae）珍贵园林观赏植物，在每年的3～4月开花，其芳香艳丽、姿态优美，有极高的观赏价值。但其仅产自江苏省句容县宝华山，数量较少，已被列为国家二级重点保护植物。由于宝华玉兰产地单一，对于环境的要求特别严格，所以人工栽培并成功的事例很少，同时由于林下灌木层不断被破坏，没有更新苗木，现已处于濒危状态[1]。面对如此严峻的形势，开展对宝华玉兰的遗传多样性分析研究、制定具有针对性的种质资源保护策略刻不容缓。简单序列重复区间扩增多态性（Inter-simpleseque

4、ncerepeats，ISSR）是由加拿大蒙特利尔大学Zietkiewicz等于1994年创建的一种分子标记技术[2]，ISSR分子标记技术兼具SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子标记的优点，与其他技术相比，ISSR不需要预先获知序列信息而使成本降低，且多态性更丰富；并且重复性高、稳定性好，同时具备简便、易操作等特点；相比之下，ISSR更快捷、成本较低、DNA用量小、安全性较高[3]。由于上述优点，ISSR在植物种质资源研究尤其是种质资源的收集和鉴定、遗传多样性分析和亲缘关系鉴别及基因定位等方面得到了广泛的应

5、用[4-9]。　　目前对宝华玉兰的研究，仅在形态学、生物生态学特性、生存现状、文献考证、群落学分析等方面有过初步研究和探索，对该物种在分子水平上的遗传多样性分析至今尚未见报道。试验通过正交试验和单因子试验，分析DNA模板、Taq聚合酶、引物、Mg2+和dNTPs5个因子用量对宝华玉兰ISSR-PCR反应的影响，建立宝华玉兰最优ISSR-PCR反应体系，以期为利用ISSR标记对其进行分子标记辅助育种、分子身份证构建和遗传多样性分析等后续研究奠定基础。　　1材料与方法　　1.1材料　　试验所需的宝华玉兰活体材料采自江苏

6、省句容县宝华山。采取植物叶片后用硅胶快速干燥，妥善保存后送回南京森林警察学院实验室。4　　1.2方法　　1.2.1宝华玉兰DNA提取取硅胶干燥的植物叶片0.1g，用研钵研磨粉碎，采用改良的十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）法抽提基因组DNA[10]。DNA的浓度和质量采用紫外分光光度法和1%琼脂糖凝胶电泳法检测。　　1.2.2宝华玉兰ISSR-PCR反应引物筛选引物参照加拿大哥伦比亚大学（UBC）网站公布的第九套ISSR引物序列进行合成。从100个ISSR引物中随机选择12条引物803、816、826、834、842

7、、848、857、863、875、886、890、897进行目标引物的筛选。初反应体系为25μL，其中Taq聚合酶（5U/μL）0.2μL，Mg2+（25mmol/L）2μL，DNA模板（20ng/μL）2μL，dNTPs（2.5mmol/L）2μL，引物（10μmol/L）1μL，MilliQ水15.3μL。扩增程序为：95℃预变性10min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共36个循环；72℃延伸10min。采用1%琼脂糖凝胶电泳进行扩增产物检测。　　1.2.3宝华玉兰ISSR-PCR反

8、应体系建立对宝华玉兰ISSR-PCR反应的5因素（Taq酶、Mg2+、DNA模板、dNTPs、引物）4水平（浓度）设置正交试验L16（45），共16个处理，每处理重复2次，建立宝华玉兰ISSR-PCR反应体系，具体信息见表1和表2。　　1.2.4宝华玉兰ISSR-PCR反应单因子试验设计对正交试验建立的ISSR-PCR反应体系进行单因子试验（Mg2+、DNA