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1、珍稀濒危植物裸果木RAPD反应体系优化探究摘要：以裸果木新鲜叶片为材料，采用改进CTAB法提取基因组DNA,在参考一般RAPD分析反应程序的基础上,研究了裸果木RAPD分析过程中的影响因素Taq酶、Mg2+、dNTP、引物、模板DNA浓度、变性时间等，建立了适于裸果木RAPD反应的PCR体系：模板DNA为4ng/uL,引物浓度为0.3nmol/L,dNTP浓度为0.5mmol/L,Mg2+浓度为2.0mmol/L,Taq酶用量为1U,ddH20补足25uL；94°C预变性5min,94°C变性45s,36°C退火40s,72°C延伸
2、1min,共30个循环，最后72瓦延伸10min,扩增结果稳定。关键词：裸果木；RAPD；反应体系；优化中图分类号：Q78文献标识码：A文章编号：1009❷5500(2012)01❷0007❷05裸果木(Gymnocarposprzewalskii)隶属石竹科(Caryophyllaceae)裸果木属(Gymnocarpos),主要分布在新疆南部山区、甘肃河西走廊、青海西部、内蒙古西部、宁夏东南部(沙坡头地区)[1]。裸果木是古地中海荒漠残遗种，属于珍稀植物，为1987年我国首批公布的国家二级保护植物，1997年被定为一级保护植
3、物。对研究我国西北和内蒙古荒漠的发生、发展、气候变化及旱生植物区系成分的起源有着非常重要的科学价值[2]。近年来，由于生存环境的恶化，及自身生物学因素，又遭樵采和骆驼啃食等人类各种经济活动的干扰和破坏，裸果木的种群数量急剧减少，分布区已日益缩小和片段化[3]。开展种群遗传学研究，制定相关的保护计划，是保护其的有效途径。目前有关裸果木的相关研究主要集中在形态解剖学[4,5]、生理生态[6-8]、组织培养和扩繁[9]以及化学成分研究：10]等方面，有关分子水平的研究较少。随机扩增多态性DNA(RAPD)技术是以P
4、CR为基础的一种分子标记,具有操作简便、快速、低成本、多态性检出率高等优点[11],在遗传多样性评价、物种分类与鉴定、遗传图谱构建等方面有广泛的应用[12,13],由于RAPD引物的随机性及较低的退火温度等导致的条件不稳定等，影响了该技术的应用。在应用该技术时，通常需要对其反应体系进行优化,以提高其稳定性。为此进行了裸果木RAPD体系的构建和优化试验，为开展裸果木种质资源保护和管理提供有价值的科学参考。1材料和方法1.1材料自2008〜2009年10月，采集了甘肃省肃北县红柳峡口子干沟一带裸果木叶片若干。试剂40个10bp大
5、小的RAPD随机引物、Taq酶、lOXTaq缓冲液、Mg2+、dNTP均购自大连宝生物有限公司；琼脂糖、DNAMarker等均购自天为时代科技有限公司。1.2方法1.2.1裸果木DNA提取及浓度、纯度检测DNA提取按改良CTAB法进行[14]。在紫外分光光度计上，检测DNA样品的浓度和纯度。1.2.2RAPD❷PCR反应体系的建立及优化PCR反应在PE480型DNA扩增仪中进行。参考一般反应体系[15],分别在25UL反应体系中加入模板DNA、Mg2+、dNTP、Taq酶、引物和ddH20o之后盖上盖子振荡混匀。设置94£预
6、变性5min,30个循环进行94°C变性45s,36°C退火40s,72°C延伸1min,72°C延伸10min。优化RAPD反应体系时，固定扩增程序，每次改变RAPD反应中的1个参数，以确定该参数对RAPD结果的影响。筛选的参数包括：（1）模板DNA质量浓度；（2）dNTPs浓度；⑶引物用量；（4）Mg2+浓度。同时对扩增程序中的退火温度和变性时间也进行优化，以找到合适的反应条件。2结果与分析2.1提取的模板DNA浓度和质量对提取的裸果木基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳。DNA条带明亮，无严重拖尾和降解现象，可见所提取的基因组DNA
7、较完整，质量较高，能应用于RAPD反应分析（图1）。与入DNA的浓度梯度进行比较，估测出DNA的浓度为100ng/uL左右。经紫外分光光度计检测，D260mm/D280mm比值均在1.6〜1.9。图1DNA电泳检结果Fig.ITheDNAelectrophoreticbandsextractedfromleaves1.2RAPD反应体系优化和程序确立1.2.1反应体系优化结果（l）DNA模板浓度根据预实验设置了0.4、2.0、4.0、6.0、8.0ng/uL5个DNA模板浓度梯度。模板DNA用量为10ng时，扩增条带暗淡；之后，随着
8、模板DNA用量的增加（2.0〜6.0ng/uL）,条带逐渐清晰、明亮，当模板DNA用量4.0ng/uL时，扩增效果最佳;其大于6.Ong/11L时，条带数目逐渐减少。这表明模板DNA用量过少时，扩增产物太少且条带也暗淡（图2）o模板D
