Western Blot 课件

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1、WWesestteerrnnBBlotlot专心做生物-生物秀www.bbioo.com配制：5ml10%分离胶3ml5%积层胶ddHO1.92.1230%Acr1.70.5PH8.8Tris1专心做生物.3PH6.8Tris-0.3820%SDS0.0250.01510%AP生物秀0.050.03www.bbioo.comTEMED0.0020.003灌制分离胶隔绝空气ddHO20.1SDS:<8%异丁醇：>8%专心做生物-生物秀www.bbioo.com灌制积层胶插入梳子专心做生物-生物秀www.bbioo.comWesternblot(immunob

2、lotting)1.WhatisWesternblot?Atechniquefordetectingspecificproteinsseparatedbyelectrophoresisbyuseoflabeledantibodies.SocalledsinceithassomesimilaritytoaSouthernblot.专心做生物-2.Whywehavetouseit?Wecanusethistechniquetoidentifyatargetproteinina生物秀complexmixture,andwecanalsouseittowww.bb

3、ioo.commeasureit’sexpressionlevel.3.Howtodoit?步骤：•Separateproteinsbygelelectrophoresis•Transferproteinsontoamembrane–Wettanktransfe专心做生物rsystem-–Semi-drytransfersystem生物秀•Identifyprotewwwins.bbioo.com–Immunodetection优点：•高分辨率的电泳技术•特异敏感的抗原-抗体反应专心做生物•1-5ng中等大小的靶蛋白-生物秀www.bbioo.com蛋白提

4、取•Totalprotein–standardlysisbuffer（lipa）•Nuclearcytoplasmicextraction(NER-PER,extractionkit,Pierce)•Topreventdegrada专心做生物tion-alwayscentrifugesamplesat4℃andincludeaproteaseinhibitor•ProteinQa生物秀ntification:www.bbioo.comStandardBCAassay(Pierce)BradfordreagentSDS-PAGE不连续电泳•PolyAcryl

5、amideGelElectrophoresis（PAGE）isthebestmethodinproteinseparate。•UsePAGEtosepara专心做生物teproteinsbyMW。-生物秀www.bbioo.comSDS：•阴离子去污剂变性剂•氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。•蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。•与强还原剂一起使蛋白分专心做生物子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线-性化。生物秀www.bbioo.com蛋白质-SDS胶束的特点：（1）具

6、有相同的形状，形状像一个长椭圆棒（2）平均1g蛋白质结合1.4g专心做生物SDS-（3）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的。（4）长轴的长度则与亚基分子生物秀www.bbioo.c量的大小成om正比PAGE：聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegel)是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)专心做生物N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，-简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械

7、强度和透明生物秀www.bbioo.com度。是良好的电泳介质。聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：•单体：丙烯酰胺（Acr）；•交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）；•催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）；•加速剂：四甲基乙二胺专心做生物（TEMED）；-•产物：三维网状结构凝胶•聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(freeradicals)生物秀的催化，使体系发生氧www化还原.bb作用ioo(cat.calystom-redoxsystems)来完成的。催化体系主要有化学催化（AP—TEMED）和光化学催化（核黄素——TMTED）体系。专心做生物-生物秀www.

8、bbioo.com影响聚丙烯酰胺凝胶聚合的因素•试剂的纯度•温度专