western blot 技术

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1、Westernblot实验技术一、原理WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶、荧光或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。WesternBl

2、ot按实验步骤分主要包括两部分：①SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（主要目的为按分子量大小对蛋白质进行分离）；②Western 印迹 （在韧性支持物上通过抗原抗体杂交后的显色强弱反应蛋白丰度）。1．SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：该技术首先在1967年由Shapir0建立，1969年由weber和Osborn进一步完善。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N’一亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)，N，N，N’，N’四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交联向成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支

3、持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响。这种电泳方法称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS—PAG

4、E)。由于SDSPAGE可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE后，就只出现一条蛋白质区带。SDS—PAGE具有以下特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重

5、复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。实验模式图结果图 2． Western 印迹 ：经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子量大小分离后的蛋白质，在电场中转移到固相支持物上（常用硝酸纤维素滤膜）。而后以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的

6、第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。转膜模式图杂交模式图二、实验准备一抗体选购流程（1）首先确定研究的抗原分子的正式及别用名，明确针对的种属，明确除WB以外拟开展的实验种类（如：FlowCyt,ICC/IF,IHC-Wmt,IHC-Fr,IHC-P,IP,）。（2）从常用信誉较好公司网站查询符合（1）中要求的抗体，国外公司包括：Abcam，ABGENT，cellsignaling，Abnova，chemicon，novus，BD，epitomics。国内推荐：三鹰，中

7、杉金桥，天德悦。仔细阅读抗体说明书，需要考虑因素包括：是否有文献已发表，抗体效价，到货周期，抗体价格，单抗多抗，包装规格，抗体克隆号，并依据一抗种属选择相应的二抗。（注意：一般国外抗体到货时间为3-5周，国内抗体3-5天）（3）订购成功后，定期与抗体代理公司联系，核实抗体状态并督促其及时到货。（4）收到抗体后，第一时间分装抗体避免反复冻融（置于冰上，推荐10ul每支分装并保存于-20℃）。妥善保管说明书，建议打印一份放实验室，原版放办公室。（5）每批订购的抗体至少保存5ul存底，用于重要实验验证。二抗选购流程二抗主要

8、选择国内抗体，本实验室选择天德悦公司产品，使用者主要需考虑种属问题。样本制备（1）样本制备前需明确实验目的，并根据下述实验方法选择合适的实验体系，如：待检测蛋白所处位置（细胞浆，细胞膜，分泌蛋白等）（2）尽量保持细胞培养的稳定性（即实验的可重复性），如:细胞的培养密度，更换培养液时间等。（3）如使用蛋白酶处理，可能会将目的蛋白降解，同时还引入了