Western Blot 蛋白印迹法 (新手)

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1、WesternBlot蛋白印迹法－－详细中文操作指南（新手适用） 这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/LPBS(pH7.3)、10％分离胶、4％浓缩校、G25

2、0考马斯亮蓝溶液、0.15mol/LNaCl溶液、2X（5X）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸， 试剂配制：（一）母液1.0mol/LTris·HClTris(MW121.14)30.29g蒸馏水       200ml溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见

3、下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。PH      HCl7.4     约17ml7.5    约16m7.6    约15ml8.0     约10ml1.74mg/ml(10mmol/L)PMSFPMSF        0.174g异丙醇      100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。0.2mol/LNaH2PO4NaH2PO4（MW119.98）   12g蒸馏水        至500ml溶解后，高压灭菌，室温保存。0.2mol/LNa2HPO4Na2HPO4·12H2O（MW358.14）

4、 71.6g蒸馏水          至1000ml溶解后，高压灭菌，室温保存。 10％SDSSDS      10g蒸馏水   至100ml50℃水浴溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺  0.1g超纯水   1.0ml溶解后，4℃保存，保存时间为1周。 1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）Tris(MW121.14)  45.43g超纯水           200ml溶解后，浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温保存。 0.5mol/LTris·H

5、Cl（pH6.8）Tris(MW121.14) 15.14g超纯水          200ml溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温保存。40％Acr/Bic（37.5：1）丙稀酰胺（Acr）     37.5g甲叉双丙稀酰胺（Bic）1g超纯水             至100ml37℃下溶解后，4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。20％Tween20Tween20     20ml蒸馏水      至100ml混匀后4℃保存。 （二）使用液单去污剂裂解液（50mmol/LTris·HClpH8.0，150m

6、mol/LNaCl，1％TritonX－100，100μg/mlPMSF）：1mol/LTris·HCl（pH8.0）   2.5mlNaCl                        0.438gTritonX－100                0.5ml蒸馏水                      至50ml 混匀后，4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/mlPMSF50μl）。0.01mol/LPBS（pH7.2-7.4）0.2mol/LNaH2PO419ml0.2mol/L

7、Na2HPO4              81ml NaCl                   17g蒸馏水                至2000ml G250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用） 考马斯亮蓝G250：100mg95％乙醇：      50ml磷酸：          100ml蒸馏水          至1000ml配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。0.15mol/LNaClNaCl（MW58.44）0.877g蒸馏水        至100ml高温灭菌后，室温保存。100mg/m

8、l牛血清白蛋白（BSA）BSA            0.1g0.15mol/LNaCl  1ml溶解后，－20℃保存。制