蛋白免疫印迹法western-blot-原理及步骤上课讲义.ppt

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1、蛋白免疫印迹法Western-blot-原理及步骤SDS-PAGE原理SDS-PAGE：是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂巯基乙醇等可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁

2、移率主要决定于亚基的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。Westernblot内容蛋白样品的制备SDS-PAGE转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色步骤蛋白样品的制备1，在冰上收细胞，用PBS清洗两次，洗去培养基。1500r,5min离心，弃去上清液。2，裂解细胞（裂解液:PI:PMSF=100:1:1）,根据所需蛋白浓度加细胞裂解液。混匀。于冰上裂解20min。3，14000r,10min离心。上清液即为所需蛋白样品液。4，用Bradford蛋白分析法测蛋白浓度。5，按100ul裂解液加30ul的6X的loading

3、buffer的比例，向蛋白样品液中添加loadingbuffer。6，于95℃，5min条件下对蛋白样品进行高温变性。SDS-PAGE:1，灌胶：（1）保证玻璃板干燥洁净，玻璃板对齐后放入夹中卡紧，垂直卡在架子上准备灌胶。（2）配好分离胶，加入TEMED，混匀后即可灌胶。灌胶过程中胶要沿着玻璃板流下，防止有气泡产生。将胶灌至接近绿带中线即可。（3）用去离子水进行液封，胶凝速度会更快（加水时速度要慢，防止胶被冲变形）（4）待水与胶之间有一条折射线的时，说明胶已经凝固。此时，可完全除去胶上层的水。（5）配制浓缩胶，加入TE

4、MED,混匀后将剩余空间灌满浓缩胶。然后插入梳子。待浓缩胶凝固后小心拔出梳子。（6）用水冲洗一下胶板，装入电泳槽中（小玻板面向内，大玻板向外；若只跑一块板，槽的另一边要放一块塑料板，有字的一面向外）2，电泳向电解槽中加入适量的RunningBuffer,将蛋白样品以50ug的标准换算出的体积进行上样。以电压120V或160V进行电泳，电泳至前沿跑至最底端即可进行转膜。转膜用硝酸纤维素膜（NC膜），进行转膜。组装转膜“三明治”的过程在Transferbuffer中进行：黑的一面在下，依次放上滤纸、凝胶、NC膜、滤纸，然后

5、合上三明治。整个过程必须保证无气泡。接着把转膜“三明治”放入转膜槽中，注意正负极放置正确。倒入适量的Transferbuffer。在冰浴中进行转膜。转膜条件：120V,1.5h或者150V，1h封闭转膜结束后，取出NC膜，按照所需蛋白的位置，裁剪NC膜。使其浸润于封闭液中，缓慢摇荡1h一抗杂交封闭过后，把NC膜放入塑料袋中，按膜的大小加入适量的一抗溶液（一抗：封闭液=1:1000），密封，在摇床上缓慢摇荡孵育4h。二抗杂交一抗孵育完成后，取出NC膜，交替加入TBST和TBS进行洗膜，一共洗三次，每次7~10min。然后

6、，再将NC膜放入塑料袋中，加入酶标二抗（一抗的抗体，含辣根过氧化物酶HRP）（二抗：封闭液=1:1000），密封，在摇床上缓慢摇荡孵育45min~1h。最后再次洗膜（同上）底物显色取上述处理过的NC膜，于干燥洁净的的玻璃板上，适当晾干。按照体积比1:1取鲁米诺和过氧化氢，混匀，滴加到NC膜上，保证NC膜完全浸润其中。静置3min，使反应完全。然后适当控干多余液体，将其平整的包裹于保鲜膜内，赶走气泡。将边缘折叠整齐，放入暗盒内，用标签纸贴牢。然后进行曝光即可。此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做

7、得更好！谢谢