western-blot-相关试剂及步骤

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1、WesternBlot蛋白测定步骤三蒸水制备后需要高压消毒一、组织的采集（一）器材和试剂准备：镊子、眼科剪、70%乙醇（三蒸水配制）、1.5mL离心管、液氮（二）步骤（以心脏为例）:1、脱颈椎处死小鼠，读取小鼠编号2、乙醇消毒胸部，剪开胸腔，剪下心脏（一颗心脏约100mg），排除血液，放入离心管，投入液氮中3、组织于-80摄氏度冻存二、组织蛋白的提取：（一）器材和试剂准备：4mL离心管、15mL管、研磨机、镊子、冰盒、离心机、RIPA蛋白裂解液（RadioImmunoprecipitationAssay，详见下载的网页）（碧云天公司）、P

2、MSF（Phenylmethanesulfonylfluoride，苯甲基磺酰氟，详见下载的网页prod号36978，ThermoScientific）、70%乙醇、三蒸水（二）步骤1、准备好三管10mL70%乙醇、一管三蒸水；取出RIPA和PMSF解冻2、按照1mLPIRA：10uLPMSF：100mg组织的比例，加试剂和组织于4mL离心管3、按照三管10mL70%乙醇、一管三蒸水的顺序依次洗涤研磨钻头（每管5秒），再研磨组织，上下且圆周运动离心管。每管研磨的转速和时间保持一致。当出现大量泡沫时即可停止4、静置于冰盒30分钟5、1200

3、0rpm，4摄氏度，30分钟6、先取100uL上清于离心管，再取300uL上清于离心管。前者用于测试，后者备用。-80摄氏度冻存。注意：购置的RIPA不宜反复冻融，需分装-80摄氏度保存；PMSF为晶体状，购置后按照说明书溶于异丙醇，分装-80摄氏度保存三、蛋白上样量定量采用BCA法测蛋白（BCAproteinassaykit，Prod号23225，详见下载的网页，ThermoScientific）：（一）器材和试剂准备：1.5mL离心管、BCA测试试剂盒、提蛋白剩余的RIPA蛋白裂解液（二）步骤1、详见BCAProteinAssayKi

4、t.pdf使用说明书，配制溶液，制作标准曲线，测定蛋白浓度。（加好各试剂，混合于37摄氏度放置30分钟）2、使用AmershamBiosciencesGeneQuantPro分光光度计的562nm测试，读数三次，取平均值（ug/mL）四、SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制（各浓度的配制见配方表）SDS-PAGE试剂配制1）30%丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺（Acrylamide）29.0g　　亚甲双丙烯酰胺（Bis-Acrylamide）1.0g　　dddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于4℃。2)分离胶缓冲液1.5mol/LTris-H

5、cl(PH8.8）Tris18.15g1mol/LHCL调节PH（可以使用分析纯级别的浓盐酸，下同）dddH2O定容至100mL，4℃保存3)浓缩胶缓冲液1.0mol/LTris-Hcl(PH6.8）：Tris12.1g1mol/LHCL调节PHdddH2O定容至100mL，4℃保存4)10%SDS溶液：SDS10.0gdddH2O定容至100ml，室温保存5）10%过硫酸铵（AP）：过硫酸铵0.1gdddH2O定容至1.0ml，4℃保存，要在一周内使用，最好新鲜配制6）TEMED遮光保存，分装于EP管冻存五、电泳（一）器材和试剂准备：电

6、泳仪、电磁锅、浮板、离心机、1.5mL离心管、Marker、5×上样缓冲液（loadingbuffer）、生理盐水、电泳液5×SDS-PAGELoadingBuffer配制方法（20mL体系总体积）：　　DTT（DL-Dithiothreitol，二硫苏糖醇）（0.1M）1.54gSDS（sodiumdodecylsulfate）　2.0g　　1MTris-CL（pH6.8）8.0mL溶解后加入10mL甘油及少量溴酚蓝定容至20mL（二）步骤1、电泳上样体系总25uL（即每孔加25uL）：（下表的列表示凝胶孔一个孔所加的试剂）　Marke

7、r管（泳道）蛋白样品管（泳道）空白管（泳道）蛋白无？无5×loadingbuffer5uL5uL5uLMarker7uL无无生理盐水13uL补齐至25uL20uL体系总体积25uL25uL25uLMarker条带依次是170、130、95、72（red）、55、43、34、26、17、10（green）KD大小的梯度。蛋白样品管的上样量的计算：40ug（这个值不一定的，可以根据算出的体积来改变。比如超过20uL则需要减少上样量。而且如果内参不齐时也需要调整）除以依据分光光度计的读数算出的蛋白浓度ug/mL（根据说明书蛋白以1：20被稀释）

8、，再转换成uL的单位。空白管的设置是因为，当蛋白样品少于9个样品时，空出的孔需要加入物质，以免蛋白跑偏。2、根据上表加好各试剂后，于270摄氏度水浴5分钟，离心，再上样，倒入电泳液3、上层胶8