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时间:2018-10-25
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1、WORD文档下载可编辑WesternBlot蛋白测定步骤三蒸水制备后需要高压消毒一、组织的采集(一)器材和试剂准备:镊子、眼科剪、70%乙醇(三蒸水配制)、1.5mL离心管、液氮(二)步骤(以心脏为例):1、脱颈椎处死小鼠,读取小鼠编号2、乙醇消毒胸部,剪开胸腔,剪下心脏(一颗心脏约100mg),排除血液,放入离心管,投入液氮中3、组织于-80摄氏度冻存二、组织蛋白的提取:(一)器材和试剂准备:4mL离心管、15mL管、研磨机、镊子、冰盒、离心机、RIPA蛋白裂解液(RadioImmunoprecipitationAssay,详见下载的网页)(碧云天公司)、P
2、MSF(Phenylmethanesulfonylfluoride,苯甲基磺酰氟,详见下载的网页prod号36978,ThermoScientific)、70%乙醇、三蒸水(二)步骤1、准备好三管10mL70%乙醇、一管三蒸水;取出RIPA和PMSF解冻2、按照1mLPIRA:10uLPMSF:100mg组织的比例,加试剂和组织于4mL离心管3、按照三管10mL70%乙醇、一管三蒸水的顺序依次洗涤研磨钻头(每管5秒),再研磨组织,上下且圆周运动离心管。每管研磨的转速和时间保持一致。当出现大量泡沫时即可停止4、静置于冰盒30分钟5、12000rpm,4摄氏度,3
3、0分钟6、先取100uL上清于离心管,再取300uL上清于离心管。前者用于测试,后者备用。-80摄氏度冻存。注意:购置的RIPA不宜反复冻融,需分装-80摄氏度保存;PMSF为晶体状,购置后按照说明书溶于异丙醇,分装-80摄氏度保存专业技术资料分享WORD文档下载可编辑三、蛋白上样量定量采用BCA法测蛋白(BCAproteinassaykit,Prod号23225,详见下载的网页,ThermoScientific):(一)器材和试剂准备:1.5mL离心管、BCA测试试剂盒、提蛋白剩余的RIPA蛋白裂解液(二)步骤1、详见BCAProteinAssayKit.p
4、df使用说明书,配制溶液,制作标准曲线,测定蛋白浓度。(加好各试剂,混合于37摄氏度放置30分钟)2、使用AmershamBiosciencesGeneQuantPro分光光度计的562nm测试,读数三次,取平均值(ug/mL)四、SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制(各浓度的配制见配方表)SDS-PAGE试剂配制1)30%丙烯酰胺溶液:丙烯酰胺(Acrylamide)29.0g 亚甲双丙烯酰胺(Bis-Acrylamide)1.0g dddH2O,37℃溶解,定容至100ml,棕色瓶存于4℃。2)分离胶缓冲液1.5mol/LTris-Hcl(PH8.8)Tris1
5、8.15g1mol/LHCL调节PH(可以使用分析纯级别的浓盐酸,下同)dddH2O定容至100mL,4℃保存3)浓缩胶缓冲液1.0mol/LTris-Hcl(PH6.8):Tris12.1g1mol/LHCL调节PHdddH2O定容至100mL,4℃保存4)10%SDS溶液:SDS10.0gdddH2O定容至100ml,室温保存5)10%过硫酸铵(AP):过硫酸铵0.1g专业技术资料分享WORD文档下载可编辑dddH2O定容至1.0ml,4℃保存,要在一周内使用,最好新鲜配制6)TEMED遮光保存,分装于EP管冻存五、电泳(一)器材和试剂准备:电泳仪、电磁锅
6、、浮板、离心机、1.5mL离心管、Marker、5×上样缓冲液(loadingbuffer)、生理盐水、电泳液5×SDS-PAGELoadingBuffer配制方法(20mL体系总体积): DTT(DL-Dithiothreitol,二硫苏糖醇)(0.1M)1.54gSDS(sodiumdodecylsulfate) 2.0g 1MTris-CL(pH6.8)8.0mL溶解后加入10mL甘油及少量溴酚蓝定容至20mL(二)步骤1、电泳上样体系总25uL(即每孔加25uL):(下表的列表示凝胶孔一个孔所加的试剂) Marker管(泳道)蛋白样品管(泳道)空白
7、管(泳道)蛋白无?无5×loadingbuffer5uL5uL5uLMarker7uL无无生理盐水13uL补齐至25uL20uL体系总体积25uL25uL25uLMarker条带依次是170、130、95、72(red)、55、43、34、26、17、10(green)KD大小的梯度。蛋白样品管的上样量的计算:40ug(这个值不一定的,可以根据算出的体积来改变。比如超过20uL则需要减少上样量。而且如果内参不齐时也需要调整)除以依据分光光度计的读数算出的蛋白浓度ug/mL(根据说明书蛋白以1:20被稀释),再转换成uL的单位。空白管的设置是因为,当蛋白样品少于
8、9个样品时,空出的孔需要加入物质,以免
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