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时间:2018-12-21
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1、WesternBlot试剂的准备1.30%储备胶溶液:丙烯酰胺(Acr) 29.0g 亚甲双丙烯酰胺(Bis) 1.0g 混匀后ddH2O,37℃溶解,定容至100ml,棕色瓶存于室温。2.4×分离胶缓冲液(1mol/LTris-HCl PH8.8) Tris 18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调PH8.8,定容至100ml。3.4×浓缩胶缓冲液(0.5mol/LTris-HCl PH6.8) Tris 12.1g加ddH2O溶解,浓盐酸调PH6.8,定容至100ml。4.10%SDS
2、:电泳级SDS10.0g加ddH2O,68℃助溶,浓盐酸调PH7.2,定容至100ml。5.5×电泳缓冲液(PH8.3): Tris 15.2g 甘氨酸 94g ddH2O 定容到1000ml SDS 5g 先在974ml蒸馏水中加入Tris碱,待溶解完全后,再加甘氨酸,最后加SDS。6.10%过硫酸铵(AP):0.1g AP加ddH2O至1.0ml,4℃保存,要在一周内使用,最好新鲜
3、配制。7.2×加样缓冲液:2×SDS加样缓冲液 0.5mol/LTris-HCl(PH6.8) 2ml 10%SDS 4ml β-巯基乙醇 1ml 甘油 2ml 1%溴芬蓝 1ml 置4℃避光保存8.TEMED:注意室温较低时TEMED量可加倍,最后灌胶之前再用9.转膜缓冲液(TowbintransferBuffer):即1×SDS-PAGE10.0.01mol/LPBS(PH7.4): NaCl 8.5g
4、 (12H2O)Na2HPO4 2.9011g (2H2O)NH2PO4 0.24g 加ddH2O定容至 1000ml11.封闭液: 1×PBS中加入 30ml 5%(V/V)脱脂奶粉 1.5g 0.02%叠氮钠 0.006g 0.05%Tween-20 0.015g12.漂洗液(PBST):含0.
5、05%Tween-20的PBS溶液 每1000mlPBS溶液中加0.5mlTween-2013.水饱和正丁醇:正丁醇 50ml ddH2O 5ml 加入瓶中震荡,使结合,存于室温。 用时取上面一相加在凝胶上面。14.考马斯亮蓝染色法试剂:一般用G250考马斯亮蓝(蛋白定量专用)染色液:90ml甲醇:水(1:1,V/V)和10ml冰乙酸的混合液中溶解G250马斯亮蓝0.25g,用Whatman1号滤纸过滤染液以去除颗粒状物质。(染色液多次回收利用) 脱色液:90ml甲醇:水(1:1,V/V)和1
6、0ml冰乙酸的混合液15.丽春红S染色色法试剂:2%乙酸, 0.5%丽春红的水溶液 脱色液:TBS16.Aprotinin:为一58氨基碱性多肽,经反复冻融后,会发生集聚,储存液应分装成小份,保存于-20度,每一小份用后应予废弃。17.PMSF:在溶液中不稳定,应在临用前从储存液中现加于裂解液中。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF,应立即用大量的水冲洗。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。PMSF通常配成10mmol/L浓度储液(1.74或17.4mg/ml溶于异丙醇中)保存于-20度。18.显色液:联苯胺显色液(DAB)
7、 DAB 2ml 10%H2O2 60μl PBS(0.1mol/LPH6.4) 10ml19.三去污裂解缓冲液 0.5mol/LTris-HCl(PH8.0) 0.785g/100ml 0.15mol/L NaCl 0.8775g/100ml 0.02%叠氮钠 0.02g/100ml 0.1%SDS 0.1g/100ml
8、超级详细配方:SDS-PAGE、蛋白转印、WesternBlot试剂配制(***整理,2004.9.6)1.5mol/LTris(PH8.8)1.称量181.7gT
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