western blot试剂的准备

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1、WesternBlot试剂的准备1.30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）        29.0g　　　　　　　　　　　亚甲双丙烯酰胺（Bis）      1.0g　混匀后ddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。2.4×分离胶缓冲液（1mol/LTris-HCl  PH8.8）  Tris  18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH8.8，定容至100ml。3.4×浓缩胶缓冲液（0.5mol/LTris-HCl  PH6.8）  Tris  12.1g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH6.8，定容至100ml。4.10%SDS：电泳级SDS10.0g加ddH2O，68

2、℃助溶，浓盐酸调PH7.2，定容至100ml。5.5×电泳缓冲液（PH8.3）：    Tris    15.2g                      甘氨酸  94g                        ddH2O    定容到1000ml                      SDS    5g　　先在974ml蒸馏水中加入Tris碱，待溶解完全后，再加甘氨酸，最后加SDS。6.10%过硫酸铵（AP）：0.1g  AP加ddH2O至1.0ml，4℃保存，要在一周内使用，最好新鲜配制。7.2×加样缓冲液：2×SDS加样缓冲液　　　0.5mol/LTris-HCl

3、(PH6.8)  2ml　　　10%SDS            4ml　　　β-巯基乙醇          1ml　　　甘油              2ml　　　1%溴芬蓝            1ml　　　置4℃避光保存8.TEMED：注意室温较低时TEMED量可加倍，最后灌胶之前再用9.转膜缓冲液(TowbintransferBuffer)：即1×SDS-PAGE10.0.01mol/LPBS(PH7.4)：    NaCl          8.5g　　　　　　　　　　　　　　　(12H2O)Na2HPO4    2.9011g　　　　　　　　　　　　　　　(2H2O)NH

4、2PO4      0.24g　　　　　　　　　　　　　加ddH2O定容至    1000ml11.封闭液:                  1×PBS中加入          30ml　　　　　　　　　　　5%（V/V）脱脂奶粉        1.5g　　　　　　　0.02%叠氮钠          0.006g　　　　　　　0.05%Tween-20          0.015g12.漂洗液（PBST）：含0.05%Tween-20的PBS溶液　　每1000mlPBS溶液中加0.5mlTween-2013.水饱和正丁醇：正丁醇  50ml　　　　　　　　　ddH2O    5

5、ml    加入瓶中震荡，使结合，存于室温。　　用时取上面一相加在凝胶上面。14.考马斯亮蓝染色法试剂：一般用G250考马斯亮蓝（蛋白定量专用）染色液：90ml甲醇：水（1：1，V/V）和10ml冰乙酸的混合液中溶解G250马斯亮蓝0.25g，用Whatman1号滤纸过滤染液以去除颗粒状物质。（染色液多次回收利用）　　　　　　　　　脱色液：90ml甲醇：水（1：1，V/V）和10ml冰乙酸的混合液15.丽春红S染色色法试剂：2%乙酸，　　　　　　　　　　　　　0.5%丽春红的水溶液　　脱色液：TBS16.Aprotinin:为一58氨基碱性多肽，经反复冻融后，会发生集聚，储存液应分装

6、成小份，保存于-20度，每一小份用后应予废弃。17.PMSF：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量的水冲洗。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。PMSF通常配成10mmol/L浓度储液（1.74或17.4mg/ml溶于异丙醇中）保存于-20度。18.显色液：联苯胺显色液（DAB）　　　　　DAB            2ml　　　　　10%H2O2            60μl　　　　　PBS(0.1mol/LPH6.4)  10ml19.三去污裂解缓冲液        0.5mol/LTris-HCl(PH8.0)      

7、0.785g/100ml        0.15mol/L  NaCl              0.8775g/100ml        0.02%叠氮钠                0.02g/100ml        0.1%SDS                  0.1g/100ml超级详细配方：SDS-PAGE、蛋白转印、WesternBlot试剂配制(***整理，2004.9.6)1.5mol/LTris(PH8.8)1．称量181.7gT