western blot试剂的准备

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时间:2018-07-29

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1、WesternBlot试剂的准备1.30%储备胶溶液:丙烯酰胺(Acr)        29.0g           亚甲双丙烯酰胺(Bis)      1.0g 混匀后ddH2O,37℃溶解,定容至100ml,棕色瓶存于室温。2.4×分离胶缓冲液(1mol/LTris-HCl  PH8.8)  Tris  18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调PH8.8,定容至100ml。3.4×浓缩胶缓冲液(0.5mol/LTris-HCl  PH6.8)  Tris  12.1g加ddH2O溶解,浓盐酸调PH6.8,定

2、容至100ml。4.10%SDS:电泳级SDS10.0g加ddH2O,68℃助溶,浓盐酸调PH7.2,定容至100ml。5.5×电泳缓冲液(PH8.3):    Tris    15.2g                      甘氨酸  94g                        ddH2O    定容到1000ml                      SDS    5g  先在974ml蒸馏水中加入Tris碱,待溶解完全后,再加甘氨酸,最后加SDS。6.10%过硫酸铵(AP):0.1g  

3、AP加ddH2O至1.0ml,4℃保存,要在一周内使用,最好新鲜配制。7.2×加样缓冲液:2×SDS加样缓冲液   0.5mol/LTris-HCl(PH6.8)  2ml   10%SDS            4ml   β-巯基乙醇          1ml   甘油              2ml   1%溴芬蓝            1ml   置4℃避光保存8.TEMED:注意室温较低时TEMED量可加倍,最后灌胶之前再用9.转膜缓冲液(TowbintransferBuffer):即1×SDS-P

4、AGE10.0.01mol/LPBS(PH7.4):    NaCl          8.5g               (12H2O)Na2HPO4    2.9011g               (2H2O)NH2PO4      0.24g             加ddH2O定容至    1000ml11.封闭液:                  1×PBS中加入          30ml           5%(V/V)脱脂奶粉        1.5g       0.02%叠氮钠    

5、      0.006g       0.05%Tween-20          0.015g12.漂洗液(PBST):含0.05%Tween-20的PBS溶液  每1000mlPBS溶液中加0.5mlTween-2013.水饱和正丁醇:正丁醇  50ml         ddH2O    5ml    加入瓶中震荡,使结合,存于室温。  用时取上面一相加在凝胶上面。14.考马斯亮蓝染色法试剂:一般用G250考马斯亮蓝(蛋白定量专用)染色液:90ml甲醇:水(1:1,V/V)和10ml冰乙酸的混合液中溶解G2

6、50马斯亮蓝0.25g,用Whatman1号滤纸过滤染液以去除颗粒状物质。(染色液多次回收利用)         脱色液:90ml甲醇:水(1:1,V/V)和10ml冰乙酸的混合液15.丽春红S染色色法试剂:2%乙酸,             0.5%丽春红的水溶液  脱色液:TBS16.Aprotinin:为一58氨基碱性多肽,经反复冻融后,会发生集聚,储存液应分装成小份,保存于-20度,每一小份用后应予废弃。17.PMSF:在溶液中不稳定,应在临用前从储存液中现加于裂解液中。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF,应

7、立即用大量的水冲洗。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。PMSF通常配成10mmol/L浓度储液(1.74或17.4mg/ml溶于异丙醇中)保存于-20度。18.显色液:联苯胺显色液(DAB)     DAB            2ml     10%H2O2            60μl     PBS(0.1mol/LPH6.4)  10ml19.三去污裂解缓冲液        0.5mol/LTris-HCl(PH8.0)      0.785g/100ml        0.15mol/L  NaCl 

8、             0.8775g/100ml        0.02%叠氮钠                0.02g/100ml        0.1%SDS                  0.1g/100ml超级详细配方:SDS-PAGE、蛋白转印、WesternBlot试剂配制(***整理,2004.9.6)1.5mol/LTris(PH8.8)1.称量181.7gT

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