western blot（免疫印迹）handbook

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1、WesternBlottingWorkflow（免疫印迹解决手册）——给您提供便利、快捷、全面的解决方略目录1WesternBlot简介11.1WesternBlot原理11.2WesternBlot优点11.3WesternBlot应用11.4WesternBlot成功要素12WesternBlot基本流程22.1蛋白样品的提取22.1.1通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白22.1.2通过层析或电洗脱法制备目的蛋白22.1.3裂解液的选择22.2蛋白样品的定量22.3蛋白样品的变性32.4SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）42.4.1SDS-PAGE基本原理42.4.2PAGE：聚

2、丙烯酰胺凝胶42.4.3聚丙烯酰胺凝胶分类52.5转膜（Trarsmembran）62.5.1转膜的定义62.5.2转移膜的选择62.5.3转膜步骤（以槽式湿转为例）72.5.4转膜注意事项72.5.5转膜后检测（此步可以省略）82.6封闭（Blocking）82.7一抗、二抗孵育(Antibodyincubation)82.7.1一抗孵育(Primaryantibodyincubation)82.7.2二抗孵育(Secondaryantibodyinucubation)92.7.3注意事项92.8蛋白检测（Detectionofproteins）——显影92.9结果分析（ResultAn

3、alysis）112.9.1对照设计112.9.2内参112.10膜的重复利用(Membranerecovery)112.10.1膜解吸的方法112.10.2方法步骤123WesternBlot常见问题分析123.1封闭液的选择123.2一抗的选择133.3优化抗原和抗体浓度的斑点杂交方法133.4电泳中的问题14213.5Westernblot结果中背景高且不均匀143.6Westernblot结果中信号弱或无信号153.7Westernblot结果中背景较高153.8Westernblot结果中杂带较多163.9WesternBlot结果中无信号或显示信号弱163.10其它现象163.

4、11安全问题164生兴生物WesternBlot产品汇总174.1蛋白抽提174.2蛋白定量184.3蛋白上样、电泳和染色184.4转膜及封闭214.5一抗、二抗孵育214.6显色23211WesternBlot简介1.1WesternBlot原理与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对

5、应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。1.2WesternBlot优点p高分辨率的电泳技术p特异敏感的抗原-抗体反应p1-5ng中等大小的靶蛋白pWesternBlot结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种优点，可检测到低至1～5ng（最低可到10～100pg）中等大小的靶蛋白。1.3WesternBlot应用p目的蛋白的表达特性分析p目的蛋白与其它蛋白的互作p目的蛋白的组织定位p目的蛋白的表达量分析1.4WesternBlot成功要素实验步骤影响W

6、esternBlot成功的要素电泳分离蛋白蛋白抽提，蛋白定量，样品制备，电泳转膜膜的选择，膜的确认，特殊处理封闭封闭液的选择，封闭条件优化漂洗漂洗液的配制与选择抗体孵育抗体选择，抗体稀释倍数优化底物孵育恰当的发光或显色底物曝光曝光时间掌控，X-光片，显影定影试剂后WesternBlot选择抗体剥离缓冲液（蛋白印迹膜再生液），底片背景去除剂212WesternBlot基本流程2.1蛋白样品的提取2.1.1通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白水溶液提取法：针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。有机溶剂提取法：对于分子中非极性

7、侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。2.1.2通过层析或电洗脱法制备目的蛋白2.1.3裂解液的选择根据检测蛋白位置选择合适的裂解液蛋白位置推荐裂解液全细胞NP-40或RIPA胞浆（可溶性蛋白）Tris-HCl胞浆（骨架结合蛋白）Tris-Triton膜蛋白NP-40orRIPA核蛋白RIPAor核蛋白提取试剂盒线粒体蛋白RIPAor线粒体分离试剂盒2.2蛋白样品的定量目前常用比色法测定样品蛋白的含量