蛋白电泳及Western blot

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1、蛋白电泳及Westernblot：一、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1.按电泳槽说明书安装玻璃板2.根据玻璃板凝胶模具的体积确定需配制凝胶的量，再分别按上表（摘自TAKARA目录附录部分）配制分离胶和浓缩胶溶液。3.将分离前胶丙烯酰胺溶液灌至两块玻璃板中间的间隙中，给浓缩胶留出足够空间(梳齿长再加1cm)。在丙烯酰胺溶液上覆盖一层双蒸水。将凝胶垂直放置于室温下。4.待聚合完成(30min)，倒掉覆盖水层，可用干净滤纸小心吸干残存的水层，将配制好的浓缩胶溶液直接灌至聚合好的分离胶上，立即在其中插入梳齿，注意不要混入气泡，将凝

2、胶垂直放置于室温下。（配制好的凝胶可在4℃冰箱中放置备用）5.将蛋白样品与等体积的2×蛋白上样缓冲液混匀后沸水浴5min，12,000r/min离心1min，离心后取上清点样到SDS聚丙烯酰胺凝胶，连接电源后电泳，浓缩胶时用8V/cm电压，待染料前沿进入分离胶后将电压提高到15V/cm继续电泳，直到溴酚蓝染料到达分离胶的底部，关掉电源。取出凝胶，准备染色。二、SDS聚丙烯酰胺凝胶的染色1.配制好考马斯亮蓝R-250染液，将胶做好记号区别正反面放入染液中，在摇床慢摇1h左右。2.移出并回收染液以备后用，将凝胶浸泡于脱色

3、液中，平缓摇动4-8小时，其间应更换脱色液三四次。试剂配方：摘自TAKARA目录附录三、Western印迹1．将蛋白质样品进行SDS-PAGE，待溴酚蓝跑出胶后（一般80V浓缩胶，120V分离胶）停止电泳。或溴酚蓝跑至底部边缘时停止电泳；2．剥胶，并将凝胶裁成合适大小，切角以做记号。切除含溴酚蓝凝胶；3．载手套剪2张定性滤纸和一张PVDF(NC)膜，它们的大小应与凝胶的大小相同（略大）。在膜的一（左）角作一记号（或剪角），与滤纸和海绵（纤维）垫浸泡于转移缓冲液中，浸湿即可；4.次序：负极（黑孔板）－>纤维垫->1－3

4、张滤纸->凝胶->PVDF（NC）膜->1-3张滤纸->纤维垫->正极板（白孔板）－>扣上吊扣－>插进预先注入转移液的转膜槽中。（各层间不得有气泡）•按上示意图，接上电源（凝胶一边接负极，PVDF（NC）膜一边接正极）（200mA，1h；150mA，2h；26V过夜；4℃）转膜时间根据你目的蛋白大小和经验来定。•关闭电源，将膜取出，用水洗3次，置塑料平板中用1ml丽春红S染色约5分钟（至清楚看到条带），去掉丽春红S，用铅笔标记蛋白Marker条带的位置，然后用蒸馏水洗去背景染料颜色；6.将膜放入塑料平板中，加入封闭液

5、（量根据所用的容量而定，以很好的盖住膜为准），置脱色摇床中缓慢摇动，室温1小时；7．弃去封闭液，用适量封闭液按照一抗的说明稀释一抗，将膜放入含一抗的封闭液中，室温平缓摇动温育1-2小时。然后尽量回收抗体溶液，-20℃保存，可重复使用。用TBST室温洗膜3次，每次用20mLTBST，每次10min；8.同样将用封闭液稀释好的二抗加入加入容量中，每张膜约5－10mL,室温摇1小时；9.尽量回收二抗，－20ºC保存或不用回收；10.将膜用TBST洗3次，每次用20mLTBST，每次10min.（可直接用TBS溶液，因为Tw

6、een-20可能将抗体洗掉）；11.提前配制好ECL或DAB显色液，如用ECL检测，需在暗房里，红灯下操作，将ECL显色液均匀加至洗好的膜上，温室放置3-5分钟（可用移液枪将显色液来回吸打至膜上），然后用保鲜膜包好，置于压片夹中，在膜上加X光片，压片（时间根据经验而定，如肉眼都可看见，测1分钟即可，如看不见，测3-5分钟，甚至30min）；12.稍晾干膜，拍照；保存膜于密闭的塑料袋中。试剂： 丽春红S（Ponceaus）染液：0.5g丽春红S溶于1mL冰乙酸中，加水至100mL；