western blot与蛋白质双向电泳的原理,方法及应用.ppt

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1、westernblot与蛋白质双向电泳的原理，方法及应用演示人：胡祺祥，张锋，余涵westernblot原理及方法1蛋白质双向电泳原理及方法2医学应用3Contents目录第1章westernblot原理及方法一.基本原理通过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，以固相载体上的这些蛋白质或者多肽作为抗原与对应的抗体起免疫反应再与酶或者同位素标记的第二抗体起作用，通过底物显色或者放射自显影来检测特定基因表达的蛋白质PAGE分离蛋白质印迹转移底物显色或者放射自显影一抗，二抗杂交二.具体的方法和步

2、骤样品制备与凝胶电泳转膜与封闭杂交与显色I.蛋白质样品制备1.向细胞悬液中加入蛋白酶抑制剂2.细胞裂解液破碎细胞（原理是表面活性剂的两亲性）3.水溶液或者有机溶剂提取（后者适用于非极性侧链多的蛋白）4.层析或者电洗脱制备目的蛋白II.SDS—PAGE电泳问：什么决定了蛋白质能走多远？首先明白：决定蛋白质运动快慢的是蛋白质带电量和蛋白质的质量那么：此处是什么起决定作用?SDS所带电荷极多蛋白质电荷相比之下可以忽略按体重分电荷III.转膜转膜两种方法1.半干法：2.湿法注意事项：IV.封闭封闭是什么?为什要要进行封闭？V.

3、杂交问：什么是一抗，二抗？一抗是指对待测蛋白有免疫反应的抗体二抗是指对一抗有免疫反应的抗体（把一抗当做抗原）问：为什么要进行两次免疫反应?1.信号放大，因为一抗可以结合多个二抗2.价格便宜，一种二抗可以对多种一抗起作用，只需要找到可以使用的二抗即可3.可以有较多的选择，而且，带标记的二抗可以直接购买缺点：二次免疫导致的非特异性条带可能影响结果VI.显色第2章蛋白质双向电泳实验原理第一向：等点聚焦电泳（IEF，isoelectricfocusing）第二向：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）等电聚焦电泳在凝胶

4、（常用聚丙烯酰胺凝胶）中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，当蛋白质放进此体系时，不同的蛋白质即移动到或聚焦于与其等电点相当的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在聚丙烯凝胶中加入阴离子去污剂SDS，SDS将蛋白质的二硫键、氢键及疏水键打开使蛋白质变性，且包裹在变性蛋白表面。SDS带有大量负电荷，使蛋白质本身带有的电荷可忽略。不同蛋白质分子的迁移率主要决定于其带有的SDS量，即蛋白质分子的大小。电泳中，不同的蛋白质根据其分子大小移动到不同位置，

5、小分子较大分子移动快。PAAG是丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺交联剂按一定比例混合，在催化剂（如过硫酸铵）作用下聚合而成的交叉网状结构的凝胶，使其产生分子筛效应。以此凝胶为支持物的电泳为PAGE实验方法与步骤样品制备IPG胶条上样第一向等电聚焦IPG胶条平衡第二向SDS-PAGE凝胶的染色图像处理分析样品制备双向电泳的最关键步骤之一原则：尽可能多地提取总蛋白质，尽可能简单的操作步骤，防止样品提取过程中的化学修饰，去除样品中核酸、盐离子等干扰物质增加样品溶解性的方法：①变性剂，使蛋白质的疏水基团暴露，降低接近疏水残基的能量

6、域。如尿素、硫脲等②表面活性剂，可溶解疏水基团，如离子去污剂SDS，非离子去污剂NP-40及两性离子去污剂CHAPS，其中CHAPS最好③还原剂，可使蛋白质展开更完全，溶解更彻底预处理细胞（清洗等）除杂质溶解破碎细胞沉淀蛋白质IPG胶条上样与第一向等点聚焦将样品与水化上样缓冲液混合，体积比约为1:4混合物加入胶条槽除去保护膜，将胶条酸性端（尖端）朝胶条槽阳极方向放入，慢慢下压，最后放入碱性端（平端），使溶液浸湿胶条，避免生成气泡在胶条上覆盖适量矿物油，盖上盖将胶条槽平放在电泳仪上，对好正负极，设定等电聚焦程序IPG胶条

7、平衡聚焦结束的胶条应立即进行平衡将胶条放入平衡缓冲液Ⅰ中，振荡15分钟将胶条放入平衡缓冲液Ⅱ中，振荡15分钟用去离子水润洗胶条1秒，用滤纸在胶条边缘吸去多余水分平衡缓冲液Ⅰ：--含DTT（二硫苏糖醇）--使变性的非烷基化蛋白质处于还原状态平衡缓冲液Ⅱ：--含碘乙酰胺--使蛋白质巯烷基化，防止其在电泳过程中重新氧化第二向SDS-PAGE胶条染色硝酸银染色优点：灵敏度高缺点：重复性低，质谱兼容性低考马斯亮兰染色优点：重复性高，质谱兼容性高缺点：灵敏度低荧光染色优点：重复性高，质谱兼容性高，灵敏度高缺点：价格贵硝酸银染色考马

8、斯亮兰染色荧光染色图像处理分析流程凝胶图像扫描图像加工斑点检查与定量凝胶配比数据分析数据呈递和解释2-DE数据库的建立第3章医学应用01过敏原检测及方法建立02诊断寄生虫病03检测基因产物表达及水平04检测病毒感染westernblot的临床应用由于许多过敏原是来着生物体的机体，尤其表现在蛋白质上。例如鱼类。鱼类是最常见的易引起过