全硫代反义寡核苷酸对卵巢癌细胞生长抑制作用

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1、全硫代反义寡核苷酸对卵巢癌细胞生长抑制作用【摘要】目的采用针对人端粒酶hTR基因的反义寡聚脱氧核苷酸，探讨端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸（antisenseoligodeoxynucleotides,ASODN）对卵巢癌HO-8910细胞端粒酶活性及细胞增殖的影响。方法①将实验分为空白对照组、脂质体对照组、端粒酶全硫代正义寡聚脱氧核苷酸（Phosphorathioatesenseoligodeoxynucleotides，PS-SODN）组和不同剂量的全硫代反义寡聚脱氧核苷酸（Phosphorat-hioateantisenseoligodeoxy

2、nucleotides，PS-ASODN）组；②脂质体介导的细胞转染后，PS-ASODN和PS-SODN分别作用于卵巢癌HO-8910细胞后并培养24、48、72h，分别采用酶联免疫吸附法（ELISA）、吖啶橙染色法、四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）、流式细胞术检测HO-8910细胞的端粒酶活性、细胞形态、体外增殖、细胞凋亡和细胞周期的改变。结果①ELISA法检测结果显示端粒酶PS-ASODN作用卵巢癌HO-8910细胞729h后端粒酶活性表达为阴性，说明端粒酶PS-ASODN能够抑制端粒酶活性；②吖啶橙染色观察细胞形态:PS-ASODN作用的

3、卵巢癌HO-8910细胞有明显凋亡现象，凋亡细胞体积缩小，染色质浓缩，说明PS-ASODN能够促进卵巢癌HO-8910细胞凋亡；③MTT实验：PS-ASODN明显抑制卵巢癌HO-8910细胞的增殖(P0.05)；浓度分别为1、2、3μmol/L反义寡聚脱氧核苷酸组均能显著抑制细胞增殖(P0.05)。而相同条件下PS-ASODN组FC-M检测发现能阻止HO-8910细胞进入DNA合成期，使S期细胞明显减少，降为5.47%,凋亡率为35.26%,表明细胞分裂增殖活动减弱，细胞被阻止在G1/S期。细胞凋亡时，细胞的DNA裂解，在流式细胞仪上呈现亚二

4、倍体凋亡峰。表明反义寡聚脱氧核苷酸能够诱导卵巢癌HO-8910细胞凋亡并促使细胞周期发生改变。根据FCM检测结果推测PS-ASODN可能通过与端粒酶RNA模板的特异性结合而阻断其表达，从而有效地抑制S期端粒酶活性，端粒合成受到抑制，使染色体末端不稳定,肿瘤细胞阻滞于M2期，细胞周期检查点监控功能增强，激活了凋亡相关基因启动细胞程序性死亡，导致肿瘤细胞凋亡。9一些学者认为［18-20］，端粒酶抑制剂对细胞的增殖抑制可能与诱导凋亡有关。而端粒酶抑制剂诱导细胞凋亡可能通过两条途径:①端粒酶活性被抑制导致端粒延伸障碍，端粒长度不能维持，当细胞分裂导致

5、端粒缩短到一定程度，通过p53等凋亡调节蛋白［21］，诱导细胞凋亡；②端粒酶活性被抑制导致一些已经处于极短的端粒不能维持功能，细胞染色体发生断裂、融合、DNA破坏，触发细胞凋亡［22］。本实验用吖啶橙染色转染反义核酸的卵巢癌HO-8910细胞，在荧光显微镜下可见，卵巢癌HO-8910细胞出现细胞膜出芽，细胞核皱缩、碎裂、凋亡小体等明显的凋亡形态学改变。本实验结果表明：（1）互补于hTR模板区的反义寡聚脱氧核苷酸明显抑制卵巢癌HO-8910细胞的增殖及端粒酶活性，作用方式呈时间和剂量依赖性，即随着反义寡聚脱氧核苷酸浓度加大和培养时间延长，抑制作

6、用逐渐增强。这主要是由于反义寡聚脱氧核苷酸封闭了hTR模板区，阻止了端粒酶合成端粒，从而有效地抑制了卵巢癌HO-8910细胞的增殖；（2）反义寡聚脱氧核苷酸转染卵巢癌HO-8910细胞后，端粒酶活性显著下降。笔者认为，很可能反义寡聚脱氧核苷酸本身不一定具有调节凋亡的作用，其对凋亡的调节可能是通过改变端粒长度所致，因为端粒长度的维持、染色体的稳定是凋亡的一个抑制因素，而端粒的缩短可触发细胞凋亡。以上结果说明反义寡聚脱氧核苷酸能够通过抑制hTR基因的表达，抑制卵巢癌HO-8910细胞端粒酶活性，从而达到抑制卵巢癌HO-8910细胞的增殖。这也为卵

7、巢癌基因治疗提供了新的靶点，结合其他治疗方法有望提高卵巢癌基因治疗的成功率。9尽管端粒酶在几乎所有恶性肿瘤都有强阳性表达，而且反义hTR寡核苷酸制剂由于特异性封闭hTR模板区而抑制了端粒酶活性，在肿瘤的治疗方面显示出巨大的潜力。但对端粒酶阳性的生殖细胞和干细胞所带来的后果不得不引起我们的关注，尤其是生殖细胞，如果针对肿瘤细胞的端粒酶抑制剂同样可以进入人生殖细胞，使其端粒酶失活，后果将是一个种属的灭绝;但也有人持不同的观点，认为正常细胞的端粒较多数肿瘤细胞的长，并且原始干细胞较少进行有丝分裂，其端粒缩短的速度远低于肿瘤细胞，因此端粒酶抑制剂的疗

8、程可在正常细胞的端粒酶耗尽前停止，当抑制端粒酶治疗结束后，正常细胞的端粒酶活性可得到修复。此外部分肿瘤细胞具有较长的端粒，而随细胞有丝分裂的进行，端粒的缩短是一个缓