端粒酶反义寡核苷酸对肝癌细胞生长的影响

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1、端粒酶反义寡核苷酸对肝癌细胞生长的影响【关键词】端粒酶;肝癌;反义寡核苷酸;细胞凋亡肿瘤细胞端粒酶RNA有11个核苷酸为端粒合成的模板，本研究利用反义寡核酸的靶向作用封闭端粒酶RNA模板序列，干预端粒合成，有望使永生化细胞的无限增殖受限。1材料与方法1．1材料肝癌细胞株:SMMC7721，正常肝细胞株：L02，购自中科院上海细胞生物技术研究所；TRAP反应试剂(宝灵曼公司产品)；BeckmanCS15R低温离心机，PerkimnElmerPCR仪，MK2酶标仪。1．2方法1．2.1端粒酶硫代反义、正义及随机序列寡核苷酸由中科院上海细胞所

2、合成与纯化，纯度为98%。序列如表1所示。表1端粒酶模板区反义、正义及随机序列寡核苷酸序列位置1.ANTISENSEGTTAGGGTTAGACAAAAAAT56～362.SENSETTTGTCTAACCCTAACTGAG45～653.CONTROLSCRAMBLEDTTTGTCTAACCCTAACTGAG1．2.2合成寡核苷酸对肝癌细胞端粒酶活性的影响1×106SMMC7721肝癌细胞培养于含10%热灭活小牛血清的1640培养液中（37℃、5%CO2）。正义、随机、反义寡核苷酸终浓度为10μmol/L（PBS为对照），作用时间分别为12、24

3、、36、48、60h。进一步观察倍比稀释后的反义寡核苷酸（浓度为10、5、2.5、1.25μmol/L）作用不同时间对细胞端粒酶活性的影响。1．2.3TRAPPCRELISA定量检测肝癌细胞端粒酶活性1．2.4端粒酶反义寡核苷酸对SMMC7721及L02细胞增殖及细胞活力的影响1×104SMMC7721及L02细胞与5μmol/L合成反义寡核苷酸共育，隔日换液，进行活细胞计数。传代培养时采用10×10cm2培养皿。1．2.5统计学方法计量资料用均数±标准差表示，计量资料比较用t检验及方差分析，率的比较采用χ2检验。P<0.05有

4、统计学意义。2结果2．1反义、正义、随机序列寡核苷酸作用不同时间对肝癌细胞株端粒酶活性的影响10μmol/L合成端粒酶反义DNA对肝癌细胞端粒酶活性具有显著抑制作用，这种抑制作用开始于12h，60h端粒酶活性被完全抑制，而正义及随机序列对细胞端粒酶活性无显著影响，见表2。表2合成DNA对SMMC7721细胞端粒酶活性的影响　　2．2端粒酶反义寡核苷酸对肿瘤细胞增殖及活力的影响5μmol/L反义、正义及随机序列寡核苷酸与1×104肝癌细胞株及正常肝细胞株共育20d（传代10次）,反义寡核苷酸显著抑制肝癌细胞增殖，正义及随机DNA无此作用，见图1,

5、3种寡核苷酸均不影响正常肝细胞株生长。5μmol/L反义DNA作用于肝癌细胞20天后细胞活力逐渐下降，25天时细胞活力下降40%，传代23～26次后全部老化死亡，见图2，正常肝细胞活力不受影响。2.3形态学变化反义寡核苷酸作用后，多数肝癌细胞表现为凋亡的形态学改变。L02细胞无形态学变化，见图3。3讨论我们的研究发现靶向端粒酶模板区的反义寡核苷酸能显著抑制肝癌细胞端粒酶活性，酶活性的下降具有浓度依赖性，对端粒酶活性的抑制发生于与肝癌细胞共育后的12～24h，而正义及随机序列则不影响肝癌细胞端粒酶活性，说明端粒酶模板区反义寡核苷酸能识别并与端粒酶

6、RNA分子通过碱基配对相互作用使癌细胞端粒酶活性降低或消失；实验还发现：反义寡核苷酸无论何种浓度，端粒酶活性的下降均发生在12h以后，这种药物作用的时间延搁可能与寡核苷酸分子进入细胞的过程有关：我们所合成的反义分子分子量为20nt，进入肝癌细胞需要一定的能量和时间，此外，反义分子进入细胞后与细胞内端粒酶靠近、整合、再特异地与其RNA以氢键结合是一个相当复杂的过程，这些细胞内的变化可能是时间延搁的主要原因。如果将肿瘤细胞的裂解液与端粒酶反义寡核苷酸共育，端粒酶活性即刻消失。从细胞生长曲线看出，端粒酶反义寡核苷酸能抑制肝癌细胞增殖，正常肝细胞株L0

7、2不表达端粒酶活性，其生长既不受正义及随机序列的干扰，也不受反义寡核苷酸的影响，说明端粒酶反义寡核苷酸是通过抑制肝癌细胞端粒酶活性而起作用的。实验结果显示肝癌细胞端粒酶活性被抑制后肝癌细胞增殖受抑，如果这一反义分子对体内细胞也有相同或相似的作用，那么其抗肿瘤应用前景就非常可观了，目前我们正在进行端粒酶反义寡核苷酸对裸鼠腹腔移植瘤的作用。肝癌细胞端粒酶活性的被抑制，意味着细胞失去了赖以永生化的分子基础。平皿培养20d的肝癌细胞，活力下降60%，40%的细胞出现凋亡的形态学改变。推测：反义分子与端粒酶RNA结合后影响了端粒酶蛋白质亚单位的构象或功能而

8、影响了端粒酶全酶的活性，端粒酶被抑制后,肿瘤细胞可发生分化、老化及凋亡。许多基础研究已发现寡核苷酸潜在的临床药用价值，我们设计合成的反义