端粒酶反义寡核苷酸片段（asodn）对膀胱癌ej细胞的作用

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1、硕士论文端粒酶反义寡核苷酸片段(ASODN)对膀胱癌EJ细胞的作用缩略语表(Abbreviation)英文缩写英文全名ASODNAntisenseoligodeoxynucleotideBPBasepairsDEPCDiethylpyroearbonateDMSODimethylsulfoxideFITCFluoreseeinisothioeyanateHTRHumantelomeraseRNAhTERTHumantelomerasereversetranseriptaseMTT3-(4，5一dimethylt

2、hiazol-2一yO-5·diphenyltetrazoliumbromidePAGEPolyaerylamidegPlelectophoresisPBSPhosphate-bufferedsalinePCRPolymerasechainreactionPCR-ELISAPolymerasechainreaction-enzymelinkedimmunosorbentassayPoDPeroxidaseTCCTransitionaleellcarcinomaofBladderTM[B3,3，，5．5／-tet

3、ramethylbenzidineTRAPTelomericrepeatamplificationProtocol中译名反义寡脱氧核苷酸碱基对焦磷酸二乙酯二甲基亚砜异硫氰酸荧光素人端粒酶RNA人端粒酶逆转录酶四甲基偶氮唑蓝聚丙烯酰胺凝胶电泳磷酸缓冲盐聚合酶链式反应聚合酶链反应．酶标法过氧化物酶膀胱移行细胞癌四甲基联苯胺端粒重复扩增反应硕士论文端粒酶反义寡核苷酸片段(ASoDN)对膀胱癌EJ细胞的作用端粒酶反义寡核苷酸片段(ASODN)对膀胱癌EJ细胞的作用硕士研究生：钟剑峰导师：高兴成主任医师专业：泌尿外科中文

4、摘要【引言】膀胱肿瘤是泌尿系统常见的恶性肿瘤，其发病机制和诊治方面的研究一直是泌尿系统肿瘤学的热点。人们一直在探索膀胱肿瘤早期诊断和治疗的新方法，随着分子生物学理论和技术的发展，肿瘤的基因诊断和治疗越来越变为现实。端粒酶的发现和深入研究有可能使其成为肿瘤基因治疗的新靶点。端粒酶是一种含有RNA链的反转录酶，能以其所含的RNA为模板合成DNA端粒结构。在正常情况下，除精原细胞和少数造血干细胞外，其余体细胞的端粒酶都处于失活状态。在动物的生殖细胞中，由于端粒酶的存在，使端粒保持着一定的长度。体细胞随着分化而失去端粒

5、酶活性。研究表明，端粒酶激活与细胞永生化关系密切，几乎所有的永生化细胞和绝大部分的恶性肿瘤组织均有明显的端粒酶活性，维持了端粒长度的相对稳定，导致细胞无限制地增殖。而正常人体细胞、部分良性肿瘤和非永生化细胞中无或仅有极低的端粒酶活性。因此，端粒酶激活在恶性肿瘤的发生、发展过程中起重要的作用。抑制端粒酶活性有可能为肿瘤基因治疗提供新的靶点。本课题围绕端粒酶与膀胱肿瘤的关系，进行两个方面的研究。l、应用反义寡核苷酸fantisenseoligodeoxynueleotide，ASODN)技术对膀胱肿瘤EJ细胞株的端

6、粒酶活性进行抑制，并观察其对EJ细胞增殖活性的影响。2、以阳离子脂质体作为端粒酶ASODN的载体，研究硫代磷酸化修饰ASODN在脂质体介导下在人膀胱癌EJ细胞中的表达率、分布特点及稳定性。2硕士论文端粒酶反义寡核苷酸片段(ASODN)对膀胱癌EJ细胞的作用【方法】设计并合成两条针对端粒酶RNA模板区的ASODN片段，直接转染人膀胱癌EJ细胞，用PCR-ELISA法检测其对培养的EJ细胞株端粒酶活性的影响；用MTT法检测其对膀胱癌EJ细胞株增殖活性的影响。针对端粒酶RNA模板设计ASODN片段，行全硫代修饰，57

7、端行FITC(异硫氰酸荧光素)标记，脂质体介导转染人膀胱癌EJ细胞后，在荧光显微镜下观察ASODN在细胞中的表达率、分布特点及稳定性。【结果】与端粒酶RNA模板区完全互补的ASODN片段能够抑制培养的EJ细胞株的端粒酶活性并且能够抑制EJ细胞株的增殖活性。结果显示，经不同浓度(Onmol／1、5Ilmol／1、101．1mol／1)ASODN处理后的EJ细胞株端粒酶活性受到抑制，具有序列特异性及剂量依赖性。经ASODN处理后的EJ细胞增殖活性逐渐下降，具有序列特异性。实验中，我们观察到经全硫代化学修饰的反义寡核

8、苷酸(ASODN)在脂质体介导下较直接加入细胞中有更高的表达率；在脂质体介导的ASODN在膀胱癌EJ细胞中的表达率高达56％～80％，表达时间达12～24h。明显优于直接加入组。[结论]1、ASODN能够抑制人膀胱肿瘤端粒酶活性及细胞增殖活性，这可能为治疗膀胱肿瘤提供一条新的有效的治疗途径。2、脂质体介导下的ASODN在人膀胱癌EJ细胞中有较高的、稳定的表达，是一种非常有

9、；{『途的膀