全硫代反义寡核苷酸抑制人膀胱癌ej细胞活性的实验研究

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1、全硫代反义寡核苷酸抑制人膀胱癌Ej细胞活性的实验研究【关键词】全硫代反义寡核苷酸；膀胱癌；端粒酶　　【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectsofantisensephosphorothioateoligodeoxynucleotides(PSASODN)ontelomeraseactivityandproliferationofbladdercarcinomaEjcell,andexplorethetreatmentvalueofPSASODNforbladdercancer.M

2、ethodsPSASODNaltransfection.EffectsofdifferentPSASODNdensityonproliferationactivityofcellproliferation,celleraseofEjinedbymethylthiazolyltetrazolium(MTT),floetermethodandELISA.ResultsTelomeraseactivityofEjcells,transfectededependedmanner.TheproliferationofE

3、jcellstransfectederaseactivity,causingtherevulsionofcelleraseactivityentforbladdercancer.　　【Keyerase　　膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤。端粒酶抑制剂能够抑制端粒酶的活性,使肿瘤细胞完全失去增殖能力，趋于分化和凋亡，成为研究热点之一。本文拟通过观察针对端粒酶模板设计的全硫代反义寡核苷酸(PSASODN)对人膀胱癌Ej细胞端粒酶活性的影响，为膀胱肿瘤基因治疗临床应用提供新的基因靶点。　　材料与方法　　1.材料人膀胱癌

4、细胞株Ej(上海细胞库)；RPMI1640培养基、胎牛血清(SIGMA公司)；PSASODN序列为5’CTCAGTTAGGGTTAGACA-3’，PSSODN序列为5’CATTTCTTGCTCTCCACG3’，均为全硫代修饰型(上海生工生物工程公司)；脂质体(BeyotimeBiotechnology公司)；半定量端粒酶检测试剂盒(大连泛邦生物公司)；离心机(上海安亭仪器厂)；流式细胞仪(美国Coulter公司)；Biocellhtl型全自动酶标仪(南京华东公司)。　　2.方法　　(1)细胞培养膀胱癌细

5、胞Ej以5×104/ml密度接种在含10%新鲜胎牛血清、100U/ml庆大霉素的RPMI1640培养液中，置37℃、5%CO2孵箱中培养，隔天换液一次，取对数生长期细胞用于实验。　　(2)细胞转染脂质体介导的全硫代反义寡核苷酸转染按说明书操作。实验分5组，每组设6个复孔。5组分别为终浓度为5μmol/L，3μmol/L及1μmol/L的ASODN组，终浓度为5μmol/L的SODN组以及正常对照组(仅加培养液)。用药后将小牛血清的浓度调至5%，以减少寡聚脱氧核苷酸的降解。24h后弃去转染液，换新鲜培养液，并继续培

6、养，收集细胞备用。　　(3)MTT法检测细胞生长抑制率细胞以5×104/ml密度接种在96孔培养板上，每孔100μl，待细胞生长活跃时加处理因素，分组同细胞转染。分别培养24h、48h、72h后检测。检测方法：每孔加入5mg/ml的MTT20μl，继续培养4h，翻板倒掉液体，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μl，轻轻振荡10min，用自动酶标仪检测540nm处的吸光度(OD)值。计算细胞生长抑制率。抑制率（％）＝(空白对照组平均OD值-PSASODN组平均OD值)/空白对照组平均OD值。　　(4)端粒酶活性检

7、测取处理因素作用24h、48h、72h后的细胞104个，PBS洗涤后离心去上清，加裂解液10μl，冰浴放置30min，4℃、15000rpm离心10min，取上清液保存于-80℃，以备端粒酶活性检测。按试剂盒说明书操作，检测每组在450nm处的OD值，并计算相应的端粒酶活性。Index=样品的OD值/标准液的OD值。结果判断:Index≥1为+；Index在0.91～0.99为+/-；Index≤0.90为-。　　(5)流式细胞仪检测取处理因素作用24h、48h、72h后的细胞106个，70%酒精固定24h，冷PB

8、S洗涤3次，15000rpm离心10min，弃上清，碘化丙啶避光染色30min，上机测试细胞凋亡。　　3.统计学处理计量资料以-±s表示，用SPSS11.5软件包处理，组间比较采用单因素方差分析及q检验。　　结果　　1.MTT检测结果5μmol/L，3μmol/L及1μmol/L的PSASODN转染Ej细胞后24h，对细胞增殖无明显抑制，与对照组比较(P