反义硫代寡核苷酸增强细胞毒药物抗乳腺癌活性的体外研究

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1、反义硫代寡核苷酸增强细胞毒药物抗乳腺癌活性的体外研宄【摘要】目的研究以HER2mRNA为靶点的反义硫代脱氧寡核苷酸HA6722单用及与紫杉醇合用时对HER2过表迗乳腺癌细胞株MDAMB453体外增殖的抑制作用。方法选择HER2过表迖的MDAMB453细胞与HER2低表达的MDAMB231细胞，MTT法观察HA6722单用及与紫杉醇合用时对两种肿瘤细胞增殖的影响；以末端转移酶介导的dUTP切口末端标记法检测细胞凋亡。结果HA6722及紫杉醇单用均可以剂量依赖方式抑制MDAMB453细胞的体外增殖，IC50值分别为土*Ll(n=3，mean±s)*±.L-lo加用低

2、剂量的HA6722可增强紫杉醇对MDAMB453细胞的抑制作用，IC50值由合用前的土•L-1降至士•L-1。联合应用时，在IC50浓度下二者之间的联合指数为土(n=3)，其对MDAMB453细胞的相互作用表现为正性协同作用。结论反义寡核苷酸HA6722与细胞毒药物紫杉醇合用对HER2过表达乳腺癌细胞的体外增殖抑制具有协同作用。【关键词】反义寡核苷酸乳腺癌HER2mRNA紫杉醇0引言乳腺癌的化学治疗近年来有了长足的进展，然而，经多线治疗仍复发转移的晚期患者的治疗，仍然十分棘手。探索包括生物靶向治疗在内的新疗法已成为近年研究的热点之本研究室的前期研究表明，以HER

3、2mRNA为靶点的特异性硫代反义寡核苷酸，可以抑制HER2过表迗乳腺癌细胞株增殖活性［1］。本研究拟对既往合成的反义寡核苷酸HA6722单用或与紫杉醇联用时的抗乳腺癌活性进行研究，试图探索乳腺癌治疗新方法。1材料与方法细胞系及培养本研究采用的细胞株有：MDAMB453,细胞培养所需的培养基为L15，内含10%的胎牛血清，置37°C、不含⑶2的培养箱中培养；MDAMB231的体外培养采用RPMI1640培养基，内含10%的胎牛血清，置37°C、含体积分数为5%的C02培养箱中培养传代。当细胞生长至80%〜85%融合时用％胰蛋白酶消化，传代和收集细胞。硫代反义寡核苷

4、酸的合成及体外脂质体转染反义寡核苷酸的靶向HER2mRNA反义寡核苷酸HA6722序列为含20个核苷酸的寡聚核苷酸，其命名原则及合成见文献报道［2］。全程硫代修饰，由北京赛百盛基因技术有限公司合成。序列如下:HA6722：57CAGCAGCCGAGCCAGCCCGA3'琼脂糖凝胶电泳结果表明反义寡核苷酸纯度符合要求。反义寡核苷酸以无血清无抗生素的L15或RPMI1640培养基溶解浓度为50umo1«L-1的溶液，过滤除菌，-20°C储存，临用时稀释至所需浓度。反义寡核苷酸体外脂质体转染按Invitrogen,GibcoBRL公司脂质体转染说明书所述方法进行。当培

5、养细胞迗到65%〜70%融合时，进行转染，具体方法见文献［3］。紫杉醇由海南海药公司提供，30mg/支，临用时以无菌生理盐水稀释成所需浓度。噻唑蓝法检测细胞活度取对数生长期的上述细胞，以不同数量接种96孔培养板，接种数量分别为：MDAMB4535X104/孔、MDAMB2312X104孔。实验组及对照组细胞培养均设三个平行孔。待细胞生长至65%〜70%融合时，用脂质体2000将不同浓度的HA6722转染细胞4〜6h，再加入同摩尔浓度的紫杉醇，随后继续培养24〜72h，倾去培养液，加新鲜配置的MTT溶液200ul，继续孵育4h，吸去MTT溶液，每孔加200y1DM

6、S0,轻轻震荡20〜30min，酶联仪测定光吸收值。细胞凋亡检测凋亡试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。以lOOnmol.L-1的HA6722及紫杉醇分别单独处理MDAMB453细胞12h,以及用50nmol•L-1的HA6722和相同浓度的紫杉醇先后作用MDAMB453乳腺癌细胞6h,收集经紫杉醇及HA6722单药或联合作用后的MDAMB453乳腺癌细胞，离心涂片，按操作说明检测细胞凋亡。细胞核内出现棕褐色沉淀为阳性，反之为阴性。凋亡指数X100%o反义药物及紫杉醇的疗效评价对数生长期的MDAMB453细胞及MDAMB231细胞经系列浓度的HA6722及紫杉醇

7、单用或联合作用后，MTT法测定0D值。紫杉醇单用时的系列终浓度为1、4、16、64、250及lOOOnmol*L-1，而HA6722单用时的系列终浓度为，32，80，200，500，1250nmol•L-1;联合应用时二者以等摩尔浓度混合，系列浓度依次为、16、40、100、250及625nmol•L-1,反应终体积为2⑻nl。生存分数f按下述公式计算：f=ODtreat/ODcontrol(1)联合方案的疗效评价按有关文献进行［4,5］，即以log(l/f1)对log作图，并行线性拟合，得曲线的X轴截距即为log，和直线斜率m，利用下述公式计算产生效应f时的单

8、药及联合时的药物浓度:D