靶向her2 mrna反义硫代寡核苷酸体外抗乳腺癌活性研究

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1、靶向HER2mRNA反义硫代寡核苷酸体外抗乳腺癌活性研究.L.编辑。【摘要】目的研究以HER2mRNA为靶点的反义硫代脱氧寡核苷酸（SODNs）HA6722对HER2过表达乳腺癌细胞株MDAMB453体外增殖的抑制作用，及HA6722对肿瘤细胞HER2表达的影响。方法选择HER2过表达的MDAMB453细胞与HER2低表达的MDAMB231细胞，MTT法观察SODNs对肿瘤细胞增殖的影响，免疫细胞化学（ICC）与RTPCR方法研究SODNs对细胞HER2蛋白及mRNA表达的影响。结果HA6722可以剂量依赖方式抑制MDAMB453细胞的体外

2、增殖，IC50值（41.8±8.1nmol·L-1,n=5,mean±s）显著低于对照序列Scramble6722（IC50=489.4±12.1nmol·L-1,n=5,P<0.01）。HA6722在蛋白水平与mRNA水平显著抑制MDAMB453细胞中HER2的表达；HA6722对MDAMB231细胞的体外增殖无显著影响（IC50=476.7±17.6nmol·L-1,n=5，P＞0.05）。结论HA6722可序列特异性地抑制HER2过表达乳腺癌细胞的体外增殖，其抑制增殖作用与靶细胞HER2表达下调有关。【关键词】反义寡核苷酸乳腺癌HER2mRNA

3、0引言乳腺癌的发生、发展涉及多基因的异常。HER2/neu（又称CerbB2）基因的异常扩增见于30%左右的乳腺癌患者。现已明确，HER2/neu基因的异常扩增或HER2受体的过表达是一种不良的预后指标[1]。反义疗法是在转录水平以反义寡核苷酸特异性结合靶mRNA，激活RNaseH，降解mRNA,阻断相应功能蛋白的表达。有研究表明[2，3],反义寡核苷酸可以抑制HER2受体的表达，进而抑制乳腺癌细胞的增殖。本研究采用本研究室设计合成的HER2特异性硫代反义寡核苷酸HA6722，观察了其对不同HER2表达水平的乳腺癌细胞株增殖活性的影响，并在mRNA和蛋白水平观察了其对

4、HER2的影响。1材料与方法1．1细胞系及培养本研究采用的细胞株有：MDAMB453（HER2过表达），细胞培养所需的培养基为L15（Gibco,BRL）内含10%的胎牛血清（FCS，Hyclone），置37℃、不含CO2的培养箱中培养；MDAMB231（HER2低表达）的体外培养采用RPMI1640（Gibco,BRL）培养基，内含10%的胎牛血清（FCS，Hyclone）,置37℃、含体积分数为5%的CO2培养箱中培养传代。1．2硫代反义寡核苷酸的合成靶向HER2mRNA反义寡核苷酸HA6722、Scramble6722序列均为含20个核苷酸的寡聚核苷酸，

5、全程硫代修饰，由北京赛百盛基因技术有限公司合成。序列如下：HA6722：5′CAGCAGCCGAGCCAGCCCGA3′Scramble:5′TCGGGCTGGCTCGGCTGCTG3′琼脂糖凝胶电泳结果表明上述反义寡核苷酸纯度符合要求。上述反义寡核苷酸以无血清无抗生素的L15或RPMI1640培养基溶解成浓度为25μmol·L－1的溶液，过滤除菌，-20℃储存，临用时稀释至所需浓度。1．3噻唑蓝（methylthiazolyltetrazolium,MTT）法检测细胞活性取对数生长期的上述细胞，以不同数量接种96孔培养板（Costar,USA）,接种数量分别为：M

6、DAMB4535×104cells/孔、MDAMB2312×104cells/孔，为避免“周边效应”，培养板的周边孔弃用。待细胞生长至80%～90%融合时，用脂质体2000将不同浓度的HA6722,Scramble6722等硫代寡核苷酸转染细胞4～6h，随后继续培养24～72h，倾去培养液，加新鲜配置的MTT溶液（0.5mg/ml）200μl,细胞在37℃，含有5%（MDAMB453细胞的培养不需CO2）的培养箱中继续孵育4h，吸去MTT溶液，每孔加200μlDMSO,轻轻震荡20～30min，酶联仪测定光吸收值（OD值）。1．4免疫细胞化学以脂质体（Lip

7、ofectamineTM2000,Invitrogen）2000将终浓度为200nM的HA6722,Scramble6722对照序列转染MDAMB453及MDAMB23136h后，以免疫组化方法检测HER2受体表达。具体方法见免疫组化试剂盒操作说明（中山公司）。简言之，将细胞涂片在枸橼酸缓冲液(6.4M枸橼酸二钠，pH6.0)中以95℃15min进行抗原修复，室温下冷却20min，用Tris缓冲液（pH7.6）冲洗涂片3min×3次，然后过氧化氢室温封闭5min，再按上述方法洗涤。涂片在37℃下用HER2单克隆抗体(鼠抗人，San