pten基因重组腺病毒对卵巢癌细胞生长的抑制作用

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1、pten基因重组腺病毒对卵巢癌细胞生长的抑制作用作者：林观平,熊亮,李树梅,黄秀兰,周克元【摘要】目的:观察携带野生型pten基因的重组腺病毒(Adpten)体外转染高转移卵巢癌HO8910PM细胞后的表达，并研究其对卵巢癌细胞抑制增殖、诱导凋亡和抑制迁移的作用.方法:利用AdEasy腺病毒载体系统构建Adpten，体外转染高转移卵巢癌HO8910PM细胞，荧光显微镜检测Adpten的转染效率.细胞中的表达；MTT实验观察pten对细胞生长的影响；HE染色法观察外源性pten基因表达对细胞形态学的影

2、响；细胞划痕实验观察pten对细胞迁移的抑制作用；Hoechest33258凋亡染色检测pten基因对HO8910PM细胞凋亡的诱导作用.结果:外源性野生型pten基因经腺病毒介导成功转入HO8910PM细胞，OI为100时，体外转染效率高达90%以上.pten显著抑制HO8910PM细胞增殖、诱导其凋亡并能抑制其迁移.结论:重组腺病毒是高效的基因转移系统，能将pten目的基因高效地转移到高转移卵巢癌HO8910PM细胞中，对细胞产生强有力的生长抑制及凋亡诱导作用，并能抑制其迁移.【关键词】卵巢肿瘤；基

3、因治疗；pten基因；腺病毒；细胞凋亡；迁移抑制0引言抑癌基因pten，即第10号染色体缺失的与张力蛋白同源的基因，是继p53后又一个与多种肿瘤发生发展密切相关的抑癌基因，其编码具有双重特异磷酸酶活性的蛋白，可以反向调控磷脂酰肌醇(3)激酶（phosphatidylinositol3kinase，PI3K）/AKt信号传导途径，从而抑制细胞生长增殖.其突变和缺失多发于乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌等［1-3］.在某些pten基因突变或缺失的癌细胞中过表达PTEN蛋白能抑制细胞增殖和肿瘤的形成，使其细胞周期停滞在

4、G1期并发生细胞凋亡［4-5］，而且在某些没有pten基因突变的癌细胞中,使pten基因过表达也能抑制这些癌细胞生长，诱导其发生凋亡［6］；另外，pten基因还能抑制癌细胞的侵润转移，降低其迁移能力.这就提示pten基因用于癌症基因治疗有着重要意义.而基因治疗载体的选择最为重要，当今运用最多最广泛的就是腺病毒(adenovirus,Ad)载体，其具有在哺乳动物及其他多种生物细胞上进行基因转移和蛋白表达的高效性和不整合宿主细胞的性质，是一种比较安全，转染效率又高的载体［7］.本研究采用携带野生型pten基因的重组

5、腺病毒(Adpten)，将pten基因导入人高转移卵巢癌HO8910PM细胞，观察其在卵巢癌细胞中的表达，研究其对卵巢癌细胞生长抑制、迁移抑制、诱导凋亡的作用，对卵巢癌的基因治疗进行初步的探索并提供有意义的参考数据.1材料和方法1.1材料人高转移卵巢癌HO8910PM细胞和人胚肾细胞293T购自中国科学院上海细胞生物学研究所；野生型pten表达质粒（erson公司产品.Hoechst33258细胞凋亡染色试剂盒购于武汉碧云天生物技术公司.1.2方法1.2.1重组腺病毒载体的构建及细胞培养应用细菌内同源重组

6、的方法，构建携带野生型pten基因的重组腺病毒Adpten及阴性对照Adgfp［8］.HO8910PM细胞培养于含100mL/L小牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素的RPMI1640培养液中，置50mL/LCO2,37℃孵箱培养.1.2.2Adpten转染效率的测定取指数生长期的高转移卵巢癌HO8910PM细胞，以5×104/孔接种于6孔培养板中，24h后吸弃培养基，换无血清RPMI1640培养基，用25，50，100感染复数(multiplicityofinfection,MOI

7、=病毒颗粒数/转染的细胞数)的腺病毒感染,培养6h后，换完全培养液继续培养.24h后在荧光显微镜下计数gfp阳性细胞百分率.确定HO8910PM细胞转染所需的MOI值，使得转染效率＞90%.1.2.3OI=100加入病毒，设Adpten组和Adgfp组，培养6h后，换完全培养液继续培养.48h后提取细胞总蛋白；以Bradford酶标仪蛋白定量法测定蛋白含量，然后作SDSPAGE（12g/L），于4℃冰箱中90mA恒流电转过夜，使目的蛋白转移至硝酸纤维素膜上,封闭液于4℃封闭过夜，将膜转至新的封袋中，按0

8、.1mL/cm2加入适量的一抗稀释液（小鼠抗人PTEN单抗按1∶300封闭液稀释，山羊抗人Actin多抗按1∶500封闭液稀释），封口后，室温下平缓摇动反应4h.TBS洗涤后加入二抗稀释液（PTEN,Actin的二抗均按1∶2000封闭液稀释），同条件反应1h.大量TBS洗涤去除未结合的二抗.ECL（化学发光）处理，暗箱中以X光胶片曝光，显影、定影.1.2.4MTT法测定HO8910