pten基因重组腺病毒对卵巢癌细胞生长的抑制作用论文

《pten基因重组腺病毒对卵巢癌细胞生长的抑制作用论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、pten基因重组腺病毒对卵巢癌细胞生长的抑制作用论文林观平,熊亮,李树梅,黄秀兰,周克元【摘要】目的:观察携带野生型pten基因的重组腺病毒(Adpten)体外转染高转移卵巢癌HO8910PM细胞后的表达，并研究其对卵巢癌细胞抑制增殖、诱导凋亡和抑制迁移的作用.方法:利用AdEasy腺病毒载体系统构建Adpten，体外转染高转移卵巢癌HO8910PM细胞，荧光显微镜检测Adpten的转染效率.细胞中的表达；MTT实验观察pten对细胞生长的影响；HE染色法观察外源性pten基因表达对细胞形态学的影响；细胞划痕实验观察pten对细胞迁移的抑制作用；Hoechest3325

2、8凋亡染色检测pten基因对HO8910PM细胞凋亡的诱导作用.结果:外源性野生型pten基因经腺病毒介导成功转入HO8910PM细胞，OI为100时，体外转染效率高达90%以上.pten显著抑制HO8910PM细胞增殖、诱导其凋亡并能抑制其迁移.结论:重组腺病毒是高效的基因转移系统，能将pten目的基因高效地转移到高转移卵巢癌HO8910PM细胞中.freelerson公司产品.Hoechst33258细胞凋亡染色试剂盒购于武汉碧云天生物技术公司.1.2方法1.2.1重组腺病毒载体的构建及细胞培养应用细菌内同源重组的方法，构建携带野生型pten基因的重组腺病毒Adpte

3、n及阴性对照Adgfp［8］.HO8910PM细胞培养于含100mL/L小牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素的RPMI1640培养液中，置50mL/LCO2,37℃孵箱培养.1.2.2Adpten转染效率的测定取指数生长期的高转移卵巢癌HO8910PM细胞，以5×104/孔接种于6孔培养板中，24h后吸弃培养基，换无血清RPMI1640培养基，用25，50，100感染复数(multiplicityofinfection,MOI=病毒颗粒数/转染的细胞数)的腺病毒感染,培养6h后，换完全培养液继续培养.24h后在荧光显微镜下计数gfp阳性细胞百分率.确定H

4、O8910PM细胞转染所需的MOI值，使得转染效率＞90%.1.2.3OI=100加入病毒，设Adpten组和Adgfp组，培养6h后，换完全培养液继续培养.48h后提取细胞总蛋白；以Bradford酶标仪蛋白定量法测定蛋白含量，然后作SDSPAGE（12g/L），于4℃冰箱中90mA恒流电转过夜，使目的蛋白转移至硝酸纤维素膜上,封闭液于4℃封闭过夜，将膜转至新的封袋中，按0.1mL/cm2加入适量的一抗稀释液（小鼠抗人PTEN单抗按1∶300封闭液稀释，山羊抗人Actin多抗按1∶500封闭液稀释），封口后，室温下平缓摇动反应4h.TBS洗涤后加入二抗稀释液（PTEN,A

5、ctin的二抗均按1∶2000封闭液稀释），同条件反应1h.大量TBS洗涤去除未结合的二抗.ECL（化学发光）处理，暗箱中以X光胶片曝光，显影、定影.1.2.4MTT法测定HO8910PM细胞增殖抑制率取对数生长期细胞，以5×103/孔接种于96孔板培养，常规条件培养24h后，吸弃培养基，换无血清RPMI1640培养基，按MOI=100加入病毒，设Adpten组，Adgfp组，PBS空白对照组和本底对照组(只加完全培养液，不种细胞)，培养6h后，换完全培养液继续培养.每个时间点设6个平行孔，在指定时间(24,48,.freelg/mL)20μL/孔，孵育4h后，小心吸弃孔内

6、上清液，加入DMSO150μL/孔，振荡10min，490nm作为测定波长，570nm作为参比波长，在酶标仪上测定各孔的光吸收值.细胞增殖抑制率=［1-实验组（A570nm-A490nm）/本底对照组（A570nm-A490nm）］×100%.1.2.5HE染色观察细胞形态取指数生长期高转移卵巢癌HO8910PM细胞，以5×104接种于35mm培养皿中，24h贴壁后，加入Adpten或Adgfp感染，并设加PBS为空白对照；病毒感染方法同1.2.4，24h后弃培养基，生理盐水漂洗，950mL/L乙醇固定15min，苏木素染色3～10min，自来水冲洗5～8min，5～10mL

7、/L盐酸酒精分化数分钟，自来水冲洗5～8min，然后加温热水5～10min显蓝，自来水充分冲洗，伊红复染2min，再次用自来水充分冲洗，普通光学显微镜下观察.1.2.6细胞划痕试验取指数生长期高转移卵巢癌HO8910PM细胞，按2×104/孔接种于6孔培养板，用RPMI1640完全培养基孵育24h后，用移液枪枪尖在细胞培养基表面划一条痕迹（长约2cm），用PBS洗3次后加入无血清RPMI1640培养基，病毒感染方法同1.2.4，设加PBS为空白对照，继续培养48h