小麦黄花叶病毒rna2 28kda蛋白基因的表达及表达产物抗血清的制备

《小麦黄花叶病毒rna2 28kda蛋白基因的表达及表达产物抗血清的制备》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、小麦黄花叶病毒RNA228kDa蛋白基因的表达及表达产物抗血清的制备中国病毒学1999年第3期第14卷研究报告作者：苏　宁　韩成贵　李大伟　侯占军　邢怡明　于嘉林　刘　仪单位：中国农业大学生物技术国家重点实验室，北京100094关键词：小麦黄花叶病毒；蛋白基因；原核表达；抗血清　　摘　要　根据小麦黄花叶病毒(WYMV)核苷酸序列测定结果，将WYMVRNA2上的28kDa蛋白基因克隆到pET11a上，构建了原核表达载体pE2839。SDS-PAGE分析表明，经IPTG诱导，28kDa蛋白基因在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中得到高效表达。以含

2、表达产物的凝胶为抗原，免疫家兔，首次制备了小麦黄花叶病毒RNA2蛋白特异性抗血清。Overexpressionof28kDaProteinEncodedby　　WheatYellowMosaicVirusRNA2inE.coliSuNingHanChengguiLiDaweiHouZhanjun　　XingYimingYuJialinLiuYi　　(StateKeyLaboratoryforAgrobiotechnology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094)　　AbstractWithpolym

3、erasechainreaction(PCR)afragmentencodingthe28kDaproteinofwheatyellowmosaicvirus(WYMV)RNA2wasamplifiedandconstructedintoplasmidofpET11aforprokaryoticexpression.BL21(DE3)ofE.colitransformedwiththerecombinantplasmidofpE2839wasinducedtospecificallyexpressthe28kDaproteininhighleve

4、l.Theexpressed28kDaproteinwaspurifiedfromSDS-polyacrylamidegelsandtheantiserumagainsttheproteinwasraisedinrabbit.InWestern-blottinganalysis,theantiserumreactedwiththe28kDaprotein.　　KeywordsWheatyellowmosaicvirus,Proteingene,Prokaryoticexpression,Antiserum　　小麦黄花叶病是亚洲小麦产区广为流行的一

5、种真菌传病毒病害，七十年代末在我国首次报道［1］。该病害是由小麦黄花叶病毒(wheatyellowmosaicvirus,WYMV)侵染所引起的，表现为小麦植株矮化，成穗率低，严重影响小麦产量。由于其传播介体禾谷类多粘菌(Polymyxagraminis)为植物根部专性寄生真菌，其休眠孢子抗逆力强，可被释放到土壤中存活多年，所以目前除选择抗病品种外，无其它有效的防治措施。　　WYMV为大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)成员，基因组由长、短两条单链正意RNA构成［2，3］。根据WYMV相近的其他大麦黄花叶病毒属病毒的研究结果，此类病毒RNA2编

6、码两种分子量分别为28kDa和70kDa的蛋白，可能与介体的传播有关［2］。本研究在对小麦黄花叶病毒cDNA合成及序列测定的基础上(未发表)，将RNA2编码的28kDa蛋白基因片段克隆到原核表达载体中，获得了高效表达并制备了其相应的特异性抗血清，为今后对28kDa蛋白的检测和功能研究奠定了基础。　　1　材料与方法　　1.1　菌株和质粒　　大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)pLysS和原核表达载体pET11a由本室保存。含有WYMV28kDa蛋白基因片段的cDNA重组质粒pGWH44为本室克隆。　　1.2　酶及试剂　　Westernblottin

7、g试剂盒购自Promega公司。蛋白分子量标准购自Pharmacia公司。硝酸纤维素膜购自Schleicher&Schuell公司。IPTG等其他化学试剂及各种限制性内切酶或工具酶购自华美生物工程公司。引物由中国科学院微生物所技术室合成。　　1.3　PCR引物合成、基因扩增与表达载体的构建　　根据本室对WYMVRNA2cDNA的序列测定结果(GenBank登录号：AF041041)，结合对大麦黄花叶病毒属其他病毒RNA2序列的结构分析，分别设计了针对28kDa蛋白编码区上、下游两端序列的引物P1和P2。引物具体序列如下：　　引物P1：5′-TTT

8、CCAGTACTATGGCATCCACCAG-3′与WYMVRNA2的148～173核苷酸(nt)相对应，并引入一个ScaⅠ位点。　　引