bcr-abl癌蛋白片段的表达、纯化及其抗血清的制备

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时间:2018-10-28

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1、BCR/ABL癌蛋白片段的表达、纯化及其抗血清的制备  摘要:目的克隆并表达bcr/abl融合基因片段,并制备其抗血清.方法PCR扩增包含蛋白融合点的bcr/abl癌基因片段,序列测定后克隆入带有His标签的原核表达载体pET-16b,转化宿主菌BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达结果,Ni-NTA树脂亲和纯化,皮下多点注射免疫小鼠,ELISA确认抗血清的滴度.结果PCR扩增得到大小约523bp的目的片段,序列测定表明与发表序列完全一致;得到了一种新的癌基因bcr/abl片段的原核表达载体pET-16b-bcr/abl,在BL21中表达可见于Mr21×103处有一蛋白新生带,表

2、达的BCR/ABL蛋白免疫小鼠后,ELESA确认抗血清的滴度>1∶2000.结论成功的克隆、表达了bcr/abl融合基因片段,并制备了相应的抗血清.  Keymuneserum  Abstract:AIMTocloneandtoexpressbcr/ablfusiongenefragmentandtoproduceimmuneserumagainsttheexpressedfusionprotein.METHODSPCR-amplifiedbcr/ablgenefragmentidpET-16baneidpET-16-bcr/abl(pEb).TheBCR/ABLfusionprotei

3、ned,Mice-munizedbysubcutaneouslymulti-siteinjectionplifiedbcr/ablgenefragmentidpEbolecularsizeofBCR/ABLproteinexpressionorethan1∶2000.CONCLUSIONFragmentofbcr/ablfu-siongeneissuccessfullyclonedandexpressed.TheantiserumofBCR/ABLproteinfragmenthasbeenproduced.  0引言  慢性粒细胞白血病(Chronicmyelogenousleukemia,

4、CML)是起源于骨髓造血干细胞的恶性肿瘤.绝大多数CML患者的肿瘤细胞带有染色体异常,即9∶22号染色体易位,形成特征性的费城染色体(Pheladophia,ph染色体)[1,2].在分子水平,这一染色体易位造成bcr基因和abl基因的融合,表达的BCR/ABL融合蛋白具有持续性的激酶活性,引起细胞的转化[2].Bcr/abl融合蛋白被认为是CML特异性肿瘤抗原,可作为CML诊断和治疗的指标[3-6].我们用PCR扩增了BCR/ABL融合蛋白的基因片段,并在大肠杆菌中进行了表达.表达产物经纯化复性后,用于免疫小鼠,得到可识别该抗原的小鼠抗血清.  1材料和方法  1.1细菌和质粒大肠杆菌XL-

5、10gold由本室保存.质粒pET-16b及大肠杆菌BL21均来自Nav-agene公司.带有人bcr/abl(b3a2)融合基因的质粒pGD210由本校附属唐都医院血液科刘立博士提供.  1.2引物设计与bcr/abl融合基因表达质粒的构建DNA重组所用试剂来自Promega、宝生物工程公司及华美生物工程公司.以质粒pGD210为模板,用PCR扩增了bcr/abl基因跨越融合点的523bp基因片段(93aa-265aa).PCR引物的序列为:上游引物:5’-CTCGAGACGTTCCTGATCTCCTCT;下游引物:5’-GGATCCTTAGTAGTTGCTTGGGACC-CA.PCR产物经

6、电泳回收纯化后插入pGEM-T载体(Promega),进行DNA序列分析.从正确克隆的载体中,用XhoI和BamHI双酶切下含有bcr/abl融合基因插入片段,插入质粒pET-16b,得到表达BCR/ABL融合蛋白的质粒pET-bcr/abl(Fig1),以下简称pEb.  1.3重组蛋白的诱导表达和纯化用表达质粒pEb转化大肠杆菌BL21,加入IPTG至终浓度1mmol・L-1,诱导不同时间后,收集菌体.悬浮于PBS,超声裂菌,离心弃去上清.向沉淀中加入2mol・L-1尿素,离心除去杂蛋白.再用8mol・L-1尿素溶解沉淀的蛋白,在Ni-NTA-ag

7、arose柱(Vector公司)上进行亲和层析.用250mmol・L-1咪唑洗脱.收集洗脱的蛋白,透析后冻干保存.  图1略  1.4抗血清的制备BALB/c小鼠由第四军医大学实验动物中心提供,用50μg基因重组的BCR/ABL融合蛋白与等量的福氏佐剂混后皮下多点注射,每周一次,第四周腹腔注射加强一次,加强免疫后14天取血,分离血清备用.  1.5酶联免疫试验(ELISA)向96孔板

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