bcr-abl癌蛋白片段的表达、纯化及其抗血清的制备论文

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1、BCR/ABL癌蛋白片段的表达、纯化及其抗血清的制备论文.freelmuneserumAbstract:AIMTocloneandtoexpressbcr/ablfusiongenefragmentandtoproduceimmuneserumagainsttheexpressedfusionprotein.METHODSPCR-amplifiedbcr/ablgenefragmentidpET-16baneidpET-16-bcr/abl（pEb）.TheBCR/ABLfusionproteined，Mice-munizedbysubcutaneouslymulti-s

2、iteinjectionplifiedbcr/ablgenefragmentidpEbolecularsizeofBCR/ABLproteinexpressionorethan1∶2000.CONCLUSIONFragmentofbcr/ablfu-siongeneissuccessfullyclonedandexpressed.TheantiserumofBCR/ABLproteinfragmenthasbeenproduced.0引言慢性粒细胞白血病（Chronicmyelogenousleukemia，CML）是起源于骨髓造血干细胞的恶性肿瘤.绝大多数CML患者的肿

3、瘤细胞带有染色体异常，即9∶22号染色体易位，形成特征性的费城染色体（Pheladophia，ph染色体）［1，2］.在分子水平，这一染色体易位造成bcr基因和abl基因的融合，表达的BCR/ABL融合蛋白具有持续性的激酶活性，引起细胞的转化［2］.Bcr/abl融合蛋白被认为是CML特异性肿瘤抗原，可作为CML诊断和治疗的指标［3-6］.我们用PCR扩增了BCR/ABL融合蛋白的基因片段，并在大肠杆菌中进行了表达.表达产物经纯化复性后，用于免疫小鼠，得到可识别该抗原的小鼠抗血清.1材料和方法1.1细菌和质粒大肠杆菌XL-10gold由本室保存.质粒pET-16b及大肠杆

4、菌BL21均来自Nav-agene公司.带有人bcr/abl（b3a2）融合基因的质粒pGD210由本校附属唐都医院血液科刘立博士提供.1.2引物设计与bcr/abl融合基因表达质粒的构建DNA重组所用试剂来自Promega、宝生物工程公司及华美生物工程公司.以质粒pGD210为模板，用PCR扩增了bcr/abl基因跨越融合点的523bp基因片段（93aa-265aa）.PCR引物的序列为:上游引物:5’-CTCGAGACGTTCCTGATCTCCTCT;下游引物:5’-GGATCCTTAGTAGTTGCTTGGGACC-CA.PCR产物经电泳回收纯化后插入pGEM-T载

5、体（Promega），进行DNA序列分析.从正确克隆的载体中，用XhoI和BamHI双酶切下含有bcr/abl融合基因插入片段，插入质粒pET-16b，得到表达BCR/ABL融合蛋白的质粒pET-bcr/abl（Fig1），以下简称pEb.1.3重组蛋白的诱导表达和纯化用表达质粒pEb转化大肠杆菌BL21，加入IPTG至终浓度1mmolL-1，诱导不同时间后，收集菌体.悬浮于PBS，超声裂菌，离心弃去上清.向沉淀中加入2molL-1尿素，离心除去杂蛋白.再用8molL-1尿素溶解沉淀的蛋白，在Ni-NTA-agarose柱（Vector公司）上进行亲和层析.用250mmo

6、lL-1咪唑洗脱.收集洗脱的蛋白，透析后冻干保存.图1略1.4抗血清的制备BALB/c小鼠由第四军医大学实验动物中心提供，用50μg基因重组的BCR/ABL融合蛋白与等量的福氏佐剂混后皮下多点注射，每周一次，第四周腹腔注射加强一次，加强免疫后14天取血，分离血清备用.1.5酶联免疫试验（ELISA）向96孔板中加入纯化的BCR/ABL融合蛋白（5μg/μL）100μL，4℃包被过夜.加入稀释的经免疫小鼠的血清与未经免疫小鼠的血清，血清稀释度均为1∶500，1∶1000，1∶2000，1∶4000，1∶8000，1∶16000，设一阴性对照孔，37℃水浴1h，加入酶标抗体，

7、37℃1h，TMB显色15～30min，酶联免疫检测仪测定，测定波长为492nm.1.6DNA序列分析按说明书用PE公司的荧光DNA序列测定试剂盒（Big-dye）进行序列测定反应，用310型DNA序列测定仪进行电泳及结果分析.2结果2.1bcr/abl基因的亚克隆为表达BCR/ABL融合蛋白融合点两侧约200个氨基酸的片段.以全长bcr/abl基因为模板，用PCR扩增了这一片段的cD-NA.Fig2显示523bp的目的片段被扩增出来.将这一片段插入T载体后，进行DNA序列分析，但在5’和3’端分别插入了设计的XhoI和Bam